基于Epac1-MEK 通路探討黃芩苷對脊神經結扎模型大鼠的保護機制

蔣海斌 張鐵峰 連吉 楊建美 柴金花 張蕾 安敏 王學清

（1 蘭州市第一人民醫院麻醉科,甘肅 蘭州 730050;2 陜西省腫瘤醫院麻醉科;3 蘭州市第一人民醫院疼痛科;4 甘肅省第三人民醫院麻醉科）

神經病理性疼痛（NP）是因中樞神經或外周神經的損傷導致的病理性疼痛〔1〕，臨床特征以自發疼痛、痛覺過敏、疼痛異常等為主，疾病類型包括三叉神經痛、帶狀皰疹后神經痛、坐骨神經痛等〔2〕，如今隨著社會的發展，NP 發病率逐年上升，且目前還沒有特別有效的治療手段，故尋找安全有效的治療藥物是目前臨床的研究熱點〔3〕。黃芩苷（BA）是傳統的清熱解毒中藥黃芩的主要有效活性成分，可抗氧化、抗炎、抗菌，具有鎮靜及減輕心腦血管損傷的作用，能緩解痛風性關節炎患者疼痛癥狀，并可降低炎癥因子釋放，改善神經病理性疼痛模型大鼠機械性痛覺超敏癥狀〔4～6〕，但其藥理機制目前尚不清楚。研究發現，小膠質細胞活化導致的脊髓背角神經炎癥是神經病理性疼痛的主要病理基礎〔7〕，環磷酸腺苷活化交換蛋白（Epac）1 可調控絲裂原活化的細胞外信號調節激酶（MEK）磷酸化參與介導炎癥過程，下調Epac 信號可抑制炎癥反應，緩解炎癥后痛覺過敏〔8，9〕，因而推測BA 可能通過調控Epac1-MEK 通路影響炎癥反應，進而影響脊神經結扎（SNL）模型大鼠疼痛癥狀，基于此，本研究通過建立SNL 模型大鼠，基于Epac1-MEK 通路探討BA 對SNL 模型大鼠的保護機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SD 大鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物生產許可證號:SCXK（京）2018-0011，清潔級，體重180～220 g。在清潔級的動物房中適應飼養，動物房噪音小于85 db，大鼠飲食、飲水不加限制，通風換氣:10～20 次/h，光照:12 h/12 h 明暗交替循環，溫度:22～25℃，濕度:55%～65%。

1.1.2 試劑與儀器 BA〔高效液相色譜法（HPLC）≥98%，規格:20 mg，上海源葉生物科技有限公司，批號:B20570〕；加巴噴丁（GAB，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號:20180612）；腫瘤壞死因子（TNF）-α 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（批號:ab100785）、白細胞介素（IL）-6 ELISA 試劑盒（批號:ab100772）、兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗（批號:ab181602）、兔源Epac1 一抗（批號:ab21236 ）、兔源MEK 一 抗（批號:ab178876）、兔源磷酸化MEK（p-MEK）一抗（批號:ab96379）、羊抗兔二抗（批號:ab150077）均購自美國Abcam 公司；BCA 試劑盒（批號:P0011）、蛋白裂解液（批號:P0013B）均購自上海碧云天生物技術有限公司；多道電生理記錄儀（型號:MP160）購自美國BIOPAC 公司；Von Frey 探針（型號:BIO-EVF3）購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；智能熱板儀（型號:ZH-YLS-6B）購自上海珂淮儀器有限公司；凝膠成像系統（型號:IBright CL 1500）購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；蛋白電泳儀（型號:1659001）、酶標儀（型號:Elx800）、轉膜儀（型號:Trans-Blot Turbo）購自美國Bio-Rad 公司等。

1.2 方法

1.2.1 大鼠模型制備及分組給藥 參照文獻〔10〕制備SNL 大鼠模型:腹腔注射40 mg/kg 的2.5%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，將其以俯臥位固定在操作臺上，找到大鼠背部L5 棘突后水平縱行切開皮膚，鈍性分離、暴露右側L5 橫突后將其咬除，暴露L5 脊神經，以5-0 號絲線結扎，止血、消毒后逐層縫合傷口。當大鼠術側爪出現內收，后足輕度外翻和跛行，但并未癱瘓時，表明SNL 模型大鼠建立成功，共建模68只，成功60 只，隨機分為5 組:模型組、BA 低（15 mg/kg）劑量組、BA 中（30 mg/kg）劑量組、BA高（60 mg/kg）劑量組、GAB 組（100 mg/kg），另選取12 只大鼠僅暴露L5 脊神經但不結扎，其余相同操作，設為假手術組。

以0.9%NaCl 溶液溶解BA、GAB，具體方法參考文獻〔11〕，分別配制為濃度1.5、3.0、6.0 mg/ml 的BA 溶液，濃度10 mg/ml 的GAB〔12〕溶液，建模成功后，BA 低劑量組、BA 中劑量組、BA 高劑量組及GAB 組大鼠每天灌胃干預1 次，劑量為10 ml/kg，模型組和對照組每天以10 ml/kg 劑量的0.9%NaCl溶液灌胃干預1 次，均持續干預14 d。

1.2.2 機械性疼痛刺激試驗 第14 天給藥干預結束后24 h，使用Von Frey 探針進行機械性疼痛刺激試驗，將大鼠自飼養籠中取出，適應一段時間后處于安靜狀態時，自最小克數的Von Frey 探針開始刺激大鼠結扎脊神經側足底6 s，力度以能使腳爪輕度彎曲為準，當大鼠縮爪或添足時（刺激過程中或撤除刺激后出現均可），表示其有疼痛癥狀，記錄此時Von Frey 探針的克數，即表示大鼠的縮爪閾值，可反映大鼠的機械性痛覺過敏程度，重復測試3 次，取平均值。

1.2.3 熱敏試驗 機械性疼痛刺激試驗結束后，使用智能熱板儀進行熱敏試驗，將各組大鼠置于熱板上適應一段時間，待其安靜后，打開熱板，設定并維持溫度在（44±1）℃，當大鼠舔舐結扎脊神經側足或后肢撤回時，表示其有疼痛癥狀，記錄此時所用時間，即表示大鼠的熱敏潛伏期，可反映大鼠的熱痛覺過敏程度，重復測試3 次，取平均值（本實驗為最大程度降低皮膚損害大鼠在熱板上最大時間不超過60 s）。

1.2.4 神經傳導速率試驗 熱敏試驗結束后，以1.2.1 中麻醉方法麻醉大鼠，然后以俯臥位將其固定在操作板上，于結扎脊神經側閉孔附近神經區、同側頸神經踝關節區各插入一個指示電極，分別作為近端刺激點和遠端刺激點，再將一個參比電極插入近端刺激點附近約1 cm 處，以單矩形脈沖刺激0.2 ms，電壓:1.5 V，使用多導生理記錄儀記錄動作電位并計算神經傳導速度（m/s）=兩個刺激點之間距離（L）/近端刺激點和遠端刺激點之間的動作電位延遲時間差（T），重復測試3 次，取平均值。

1.2.5 大鼠血清中IL-6、TNF-α 水平測定 神經傳導速率試驗結束后，各組大鼠以注射器自尾靜脈采血，靜置，離心，小心吸出上清液（血清），以試劑盒通過ELISA 測定其中IL-6、TNF-α 水平。

1.2.6 各組大鼠脊髓組織Epac1-MEK 通路相關蛋白表達的檢測 尾靜脈取血后將大鼠斷頭處死，解剖，取出腰椎中脊髓組織，剪為小碎塊后置于含有蛋白裂解液的玻璃管中，勻漿，離心，以試劑盒通過BCA 法測定上清中的總蛋白濃度，具體操作步驟按照說明書指導進行，分別取含相同質量總蛋白的各組蛋白樣品液上樣，十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），濕轉，以5%的脫脂奶粉室溫封閉聚偏氟乙烯（PVDF）膜上蛋白，將GAPDH、Epac1、MEK 及p-MEK 蛋白條帶截取下，分別置于孵育盒中孵育一抗，洗膜后孵育二抗，洗膜后通過增強化學發光法顯色，以凝膠成像儀拍攝條帶，并以Image Lab 軟件分析圖像，定量各蛋白灰度值后，統計分析得出其相對表達量。

1.3 統計學分析 采用SPSS24.0 軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結果

2.1 各組大鼠縮爪閾值 與假手術組比較，模型組縮爪閾值顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，BA 低劑量組、BA 中劑量組、BA 高劑量組及GAB 組大鼠縮爪閾值增高且BA 各組之間呈劑量依賴性（P＜0.05）；BA 高劑量組與GAB 組比較無顯著差異（P＞0.05），見表1。

2.2 各組熱敏刺激測定結果 與假手術組比較，模型組熱敏潛伏期顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，BA 低劑量組、BA 中劑量組、BA 高劑量組及GAB 組熱敏潛伏期增高且BA 各組之間呈劑量依賴性（P＜0.05）；BA 高劑量組與GAB 組比較無顯著差異（P＞0.05），見表1。

2.3 各組神經傳導速度 與假手術組比較，模型組神經傳導速度顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，BA 低劑量組、BA 中劑量組、BA 高劑量組及GAB 組大鼠神經傳導速度增高且BA 各組之間呈劑量依賴性（P＜0.05）；BA 高劑量組與GAB 組比較無顯著差異（P＞0.05），見表1。

2.4 各組血清中IL-6、TNF-α 水平 與假手術組比較，模型組血清中IL-6、TNF-α 水平顯著增高（P＜0.05）；與模型組比較，BA 低劑量組、BA 中劑量組、BA 高劑量組及GAB 組血清中IL-6、TNF-α 水平降低且BA 各組之間呈劑量依賴性（P＜0.05）；BA 高劑量組與GAB 組比較，無顯著差異（P＞0.05），見表1。

2.5 各組脊髓組織Epac1-MEK 通路相關蛋白表達 與假手術組比較，模型組脊髓組織Epac1、p-MEK蛋白表達顯著增高（P＜0.05），MEK 蛋白表達無顯著差異（P＞0.05）；與模型組比較，BA 低劑量組、BA中劑量組、BA 高劑量組及GAB 組脊髓組織Epac1、p-MEK 蛋白表達降低且BA 各組之間呈劑量依賴性（P＜0.05），MEK 蛋白表達無顯著差異（P＞0.05）；BA 高劑量組與GAB 組比較無顯著差異（P＞0.05），見表1、圖1。

表1 各組縮爪閾值、熱敏潛伏期、神經傳導速度、血清IL-6、TNF-α 水平、Epac1-MEK 通路相關蛋白表達比較(,n=12)

表1 各組縮爪閾值、熱敏潛伏期、神經傳導速度、血清IL-6、TNF-α 水平、Epac1-MEK 通路相關蛋白表達比較(,n=12)

與假手術組比較:1）P＜0.05；與模型組相比:2）P＜0.05；與BA 低劑量組相比:3）P＜0.05；與BA 中劑量組相比:4）P＜0.05

圖1 Western 印跡檢測各組脊髓組織Epac1-MEK 通路相關蛋白表達

3 討論

NP 致病因素很多，其中帶狀皰疹、糖尿病導致的神經系統病變、感覺神經系統受損、截肢手術等是其中主要的幾種〔13〕，隨著NP 病情進展，患者疼痛加重，輾轉難眠，最終可造成抑郁、焦慮等精神障礙疾病，嚴重影響患者正常工作生活，危害其身心健康〔14〕，因此找到NP 的有效治療手段具有重大的臨床和社會意義。SNL 模型能較全面地反映NP 患者痛覺過敏、自發性疼痛等臨床癥狀，廣泛應用于NP的基礎研究中〔15〕，另有研究顯示〔16〕，當機體外周或中樞神經受到損傷時，活化的免疫細胞可合成分泌IL-6、TNF-α 等炎癥因子，引發神經炎癥，導致神經疼痛。本研究通過建立SNL 模型大鼠進行實驗，結果顯示，建模大鼠血清IL-6 及TNF-α 水平顯著增高，表明建模大鼠發生神經炎癥反應，另外大鼠熱敏潛伏期、縮爪閾值、神經傳導速度相比正常大鼠也顯著降低，表明大鼠機械性及熱痛覺過敏，出現疼痛癥狀，且神經傳導功能顯著損傷，揭示SNL 模型建立成功。

BA 作為傳統中藥黃芩的主要有效成分，據張仲景《傷寒雜病論》記載，具有清熱解毒，涼血燥濕之功效，可用于組成治療疼痛的組方，并對神經病理性疼痛大鼠機械性痛覺超敏癥狀具有改善作用〔6，17〕，但其具體作用機制目前還未完全闡明。有研究認為，神經損傷能導致脊髓小膠質細胞的異常活化，使其產生大量炎性細胞因子、介質及神經活性分子，進而促進病理性疼痛的進一步發展和持續〔18〕，Epac1可介導MEK 的激活，調控其磷酸化水平，進而參與炎癥的發生及發展〔8，9〕，另外Epac1 信號還可介導持續性炎性疼痛及慢性疼痛的發生及進展，下調該信號可減輕疼痛，緩解手術后疼痛〔19，20〕，表明Epac1-MEK 通路是調控SNL 模型大鼠疼痛癥狀的重要信號，但BA 對SNL 大鼠脊髓Epac1-MEK 通路的影響目前并不清楚，本研究實驗結果表明BA 可下調Epac1-MEK 信號通路蛋白表達，抑制大鼠神經炎癥，緩解其機械性和熱痛覺過敏癥狀，修復大鼠神經傳導功能，高劑量的BA 與陽性對照藥GAB 的療效相似，揭示BA 可抑制Epac1-MEK 信號激活，并改善SNL 大鼠神經疼痛癥狀。

綜上所述，BA 可降SNL 模型大鼠脊髓炎性因子水平，抑制神經炎癥，減輕其疼痛癥狀，并修復大鼠受損神經傳導功能，最終緩解其臨床癥狀，干擾Epac1-MEK 信號途徑傳導可能是其藥理機制之一，但本研究尚未通過該通路激動劑和抑制劑做回復實驗，進行對照驗證，證據還存在一定不足，后續還會繼續研究，以便深入探討BA 治療NP 的藥理機制。