苯甲酸鈉預處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用及機制

黃糧 吳瑞霞 吳剛 成忠 （武漢市第四醫院心血管內科,湖北 武漢 430000）

動脈粥樣硬化性疾病是導致死亡和殘疾的重要原因。其中，心肌梗死有較高的發病率和死亡率，目前認為經皮冠狀動脈介入治療和溶栓治療是最有效的治療方法〔1，2〕。然而，心肌梗死后再灌注可能引起再次損傷，如何預防心肌缺血再灌注（I/R）損傷一直是醫學研究的重點。苯甲酸鈉（NaB）是肉桂的代謝產物。它通常用作調味材料和各種食品和化妝品的防腐劑〔3〕。NaB 很早就已應用于臨床，Williams等〔4〕報道，NaB 能緩解D-絲氨酸誘導的腎毒性。在小鼠實驗中，用NaB 能通過上調Treg 細胞緩解實驗性腦脊髓炎〔5〕。NaB 還被用作治療由肝代謝缺陷引起的高氨血癥及兒童尿素循環缺陷〔6，7〕。而NaB 對于心肌缺血再灌注損傷的研究未見報道，本研究擬通過建立大鼠I/R 損傷模型，探索NaB 在I/R 損傷中的分子機制及與Akt/Nrf2 通路之間的內在聯系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 15 只8 周雄性SD 大鼠，由湖北中醫藥大學動物實驗中心提供，質量200～250 g，進入實驗前適應性環境2 w。

1.2 材料和試劑 NaB（Sigma 公司，美國），抗大鼠B 細胞淋巴瘤（Bcl）-2、Bcl-2 相關X 蛋白（Bax）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）-3、蛋白激酶B（Akt）、p-Akt、胞質核因子（NF）-E2 相關因子（Nrf）2、胞核Nrf2、血紅素氧含酶（HO）-1 單克隆抗體，內參GAPDH 及二氨基聯苯胺（DAB）顯色試劑盒（Santa Cruz 公司，美國），ApopTag?熒光素原位細胞死亡檢測試劑盒（萬類生物科技有限公司，中國），自動生化分析儀（Beckman Coulter 公司，美國），流式細胞儀（Becton 公司，美國）。

1.3 方法

1.3.1 I/R 模型的建立 SD 大鼠使用10%水合氯醛（0.4 ml/100 g）腹腔注射麻醉，固定四肢后氣管插管并連接動物呼吸機（潮氣量為1.5 ml/100 g，頻率60 次/min），安裝心電監護儀，用針型電極記錄大鼠心電圖。手術刀片刮除大鼠胸前毛發，切開皮膚:以胸骨中線為基準，起于胸鎖關節平線止于劍突上方。鈍性分離肌群，剪斷胸骨左緣處第2～4 根肋骨，開胸器撐開，將心包剪開暴露心臟。分離左冠狀動脈前降支，用2/0 T 號線結扎左側冠狀動脈前降支。肉眼觀察結扎部位缺血組織蒼白或發紺，自心肌缺血在心電圖中顯示開始，30 min 后剪掉結扎線，使心肌血流恢復，隨后保持120 min 再灌注。以心電圖改變確定I/R 造模成功:冠狀動脈左前降支結扎，ST 段明顯抬高；再灌注時，ST 段抬高后回落。假手術組只打開胸腔，不進行結扎。

1.3.2 分組及給藥 15 只大鼠隨機分為3 組:假手術（Sham）組，I/R 組和I/R+NaB 組，I/R+NaB 組在造模前3 d 利用0.1 g/kg NaB 溶于生理鹽水灌胃預處理，1 次/d，連續3 d。Sham 組，I/R 組予等量生理鹽水灌胃預處理。24 h 后快速取出心肌組織及腹主動脈血。動脈血以3 000 r/min 離心10 min，取上清液存于試管并進入實驗。

1.3.3 梗死面積和ST 段波幅 心肌組織取出后切除右心室和心房肌肉組織，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗后置于無菌臺進行大體觀察，將心肌組織按照冠狀溝平行方向切片，厚度約3 mm，拍攝并分析。梗死面積（%）=梗死面積/總面積×100%。并取再灌注120 min 后Ⅱ導聯ST 段波幅測量。

1.3.4 動脈血檢測 采用全自動生化分析儀檢測存于試管中的血清乳酸脫氫酶（LDH）、血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌鈣蛋白（cTn）I 及cTnT 水平。

1.3.5 流式細胞儀檢測心肌細胞凋亡水平 24 h后快速取下老鼠的心臟，用PBS 清洗并置于玻璃器皿中，利用均漿機將心肌組織粉碎，PBS 清洗并在1 000 r/min 4℃條件下離心5 min。收集沉淀并用PBS 清洗，在4℃條件下1 000 r/min 離心5 min。將顆粒重新懸浮在含有5 μl FITc-Annexin V 和10 μl PI 染色溶液的結合緩沖液中。將溶液在室溫下在黑暗中靜置15 min。利用300 目網過濾混合物，利用流式細胞儀分析細胞凋亡。

1.3.6 TUNEL 24 h 后快速取下老鼠的心臟，用PBS 清洗，放在玻璃器皿中，將心肌組織按照冠狀溝平行方向切片，厚度約3 mm。按照ApopTag?熒光素原位細胞死亡檢測試劑盒說明書操作，DAPI 使細胞核呈藍色，凋亡細胞呈綠色。凋亡率（%）=綠色陽性細胞數/總細胞數×100%。

1.3.7 Western 印跡檢測凋亡蛋白及Akt/Nrf2 通路蛋白 24 h 后快速取下老鼠的心臟，充分研磨，3 ml/g蛋白裂解液充分裂解后，10 000 r/min 離心30 min。總蛋白濃度通過二喹啉甲酸（BCA）法測定。并進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉膜，封閉，caspase-3、Bax、Bcl-2、Akt、p-Akt、胞質Nrf2、胞核Nrf2、HO-1 單克隆抗體孵育過夜，二抗1 ∶5 000 孵育3 h，加入顯色劑顯色，內參GAPDH。凝膠成像系統成像，Image J 軟件計算灰度值。

1.3.8 p-Akt 及HO-1 免疫組織化學染色 24 h 后快速取下老鼠的心臟，用PBS 清洗，放在玻璃器皿中，將心肌組織按照冠狀溝平行方向切片，厚度約3 mm。并進行進行p-Akt 及HO-1 免疫組織化學染色，利用ImagePro Plus 半定量分析其光密度值（OD）。

1.4 統計學分析 采用SPSS18.0 軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結果

2.1 梗死面積及ST 段波幅 I/R 組梗死面積顯著高于Sham 組，I/R+NaB 組梗死面積顯著低于I/R組（P＜0.05）；I/R 組ST 段波幅顯著高于Sham 組，I/R+NaB 組ST 段波幅顯著低于I/R 組（P＜0.05）。見圖1、圖2、表1。

圖1 各組心肌組織大體觀察

圖2 各組心電圖Ⅱ導聯

表1 各組梗死面積及ST 段波幅比較(,n=5)

表1 各組梗死面積及ST 段波幅比較(,n=5)

與Sham 組比較:1）P＜0.05；與I/R 組比較:2）P＜0.05；下表同

2.2 血清LDH、CK-MB、cTnI 及cTnT 水平 I/R 組大鼠血清LDH、CK-MB、cTnI 及cTnT 水平顯著高于Sham 組（P＜0.05），I/R+NaB 組大鼠血清LDH、CKMB、cTnI 及cTnT 水平顯著低于I/R 組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組血清LDH、CK-MB、cTnI 及cTnT 水平比較(,n=5)

表2 各組血清LDH、CK-MB、cTnI 及cTnT 水平比較(,n=5)

2.3 心肌細胞凋亡變化 I/R 組心肌細胞凋亡率〔（31.86±2.61）%〕 顯著高于Sham 組〔（6.48 ±0.53）%，P＜0.05〕，I/R+NaB 組心肌細胞凋亡率〔（19.63±1.54）%〕顯著低于I/R 組（P＜0.05）。見圖3。

圖3 流式細胞儀檢測各組心肌細胞凋亡

2.4 TUNEL 染色 Sham 組、I/R 組和I/R+NaB 組綠染的陽性細胞率分別為（13.6±3.5）%、（42.8±8.1）%和（35.7±6.4）%，I/R 組陽性細胞率顯著高于Sham 組和I/R+NaB 組（均P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組心肌組織細胞凋亡(TUNEL,×400)

2.5 凋亡蛋白表達 I/R 組caspase-3 和Bax 蛋白顯著高于Sham 組，Bcl-2 蛋白顯著低于I/R 組（均P＜0.05），I/R+NaB 組caspase-3 和Bax 蛋白顯著低于I/R 組，Bcl-2 蛋白顯著高于I/R 組（均P＜0.05）。見圖5，表3。

表3 各組凋亡相關蛋白表達水平比較(,n=5)

表3 各組凋亡相關蛋白表達水平比較(,n=5)

圖5 Western 印跡檢測凋亡蛋白表達

2.6 Akt/Nrf2 通路蛋白表達 Sham 組、I/R 組及I/R+NaB 組之間Akt、胞質Nrf2 蛋白表達無顯著差異（P＞0.05）；p-Akt、胞核Nrf2 及HO-1 蛋白表達I/R+NaB 組＞I/R組＞sham 組（均P＜0.05）。見圖6、表4。

圖6 Western 印跡檢測Akt/Nrf2 通路蛋白表達

表4 各組Akt/Nrf2 通路蛋白表達水平比較(,n=5)

表4 各組Akt/Nrf2 通路蛋白表達水平比較(,n=5)

2.7 p-Akt 及HO-1 免疫組織化學染色 I/R 組可見棕染的p-Akt、HO-1 蛋白，而I/R+NaB 組可見明顯p-Akt、HO-1 蛋白表達；ImagePro Plus 半定量分析顯示，Sham 組、I/R 組和I/R+NaB 組綠染的陽性細胞率分別為（7.8±3.9）%、（12.7±5.6）%和（23.9±7.1）%，I/R+NaB 組＞I/R 組＞Sham 組（均P＜0.05）。見圖7。

圖7 p-Akt 及HO-1 免疫組織化學染色(DAB,×100)

3 討論

I/R 損傷是全世界心源性死亡的主要原因之一。心肌梗死后盡管早期溶栓藥物治療可減少心肌梗死面積，但這種治療往往會誘發I/R 損傷。目前已有多種藥物被報道對I/R 損傷有效，但尚沒有一種有效藥物預防臨床I/R 損傷〔8〕。NaB 作為一種芳香羧酸的鈉鹽，已被報道有抗凋亡作用，NaB 在非細胞毒性濃度下抑制小膠質細胞中的NF-κB 活性，并降低小鼠肝組織中的NF-κB 基因表達〔9，10〕。梗死面積被認為是評估心肌梗死損傷嚴重程度的金標準，并且本研究發現NaB 可顯著抑制I/R 后心電圖ST 段波幅。表明，NaB 能抑制心肌損傷所致的生物膜系統損傷，減少收縮蛋白LDH、cTnI 及cTnT 及肌細胞特有酶CK-MB 從損傷的心肌內部進入到血液，客觀證實了NaB 能有效改善心肌損傷情況。

細胞凋亡在I/R 損傷等多種病理進程中對心肌細胞的丟失起著重要作用。已經證明，當I/R 損傷發生時，心肌細胞釋放促凋亡因子，線粒體凋亡途徑可能被激活〔11，12〕。Bax 是一種促凋亡蛋白，而Bcl-2是一種抗凋亡蛋白。當心肌缺血后，Bcl-2 與Bax 在心肌細胞都有表達，前者的過度表達能顯著抑制I/R后心肌細胞的凋亡，減少梗死面積，后者則促進心肌細胞凋亡，增加梗死面積〔13〕。本研究發現I/R 后心肌細胞大量凋亡，而NaB 能顯著抑制線粒體凋亡蛋白caspase-3、Bax 表達，提高Bcl-2 表達，提示NaB能通過抗凋亡效應保護I/R 損傷。

已有大量文獻證實Akt 通路在I/R 損傷過程中的重要保護作用〔14，15〕。Akt 磷酸化形成的p-Akt 可抑制Bax、caspase 等促凋亡蛋白形成，促進Bcl-2 生成，同時促進糖原合成酶激酶（GSK）-3β 磷酸化從而抑制細胞凋亡〔16〕。Nrf2 是細胞HO-1 表達的關鍵調節因子，Nrf2 能與Kelch 樣相關蛋白-1（Keap1）結合形成Keap1-Nrf2 復合物，并在正常生理條件下限制Nrf2 在細胞質中的表達〔17〕。Nrf2 在氧化應激或其他潛在損傷條件下從Keap1 釋放，并轉移到細胞核，在胞核中結合抗氧化反應元件序列，介導HO-1等抗凋亡基因的轉錄激活〔18〕。Akt/Nrf2 通路已被證實與HO-1 表達有關〔19〕。HO-1 是一種誘導酶，由于其能夠將血紅素降解為膽綠素或膽紅素、一氧化碳和游離鐵，因此具有很強的抗氧化活性〔20〕。此外，已經證明HO-1 作為植物源性化學物質，可通過抑制氧化損傷發揮心臟保護作用〔21，22〕。本研究提示NaB 能通過促進Akt 磷酸化、促進Nrf2 胞核易位，提高HO-1 蛋白表達抑制心肌細胞凋亡，從而發揮保護作用。

綜上，NaB 預處理通過上調Akt/Nrf2 信號軸，抑制I/R 損傷導致的心肌細胞凋亡，在一定程度上緩解了I/R 損傷進程，為預防I/R 損傷提供了新的思路。