LncRNA SNHG14 通過靶向miR-16-5p 對高糖誘導的小鼠腎臟足細胞損傷的影響

高慧禎 李鳳麗 李蕾 康志強 （鄭州大學附屬鄭州中心醫院內分泌科,河南 鄭州 450007）

糖尿病腎病是糖尿病的常見并發癥之一，臨床特征主要表現為持續性蛋白尿〔1〕。足細胞是維持腎小球濾過膜正常功能的主要成分，其損傷后可導致濾過膜電荷和孔徑屏障破壞，形成蛋白尿〔2〕。高糖（HG）是誘導足細胞凋亡、損傷足細胞的一個重要因素〔3〕，探討影響HG 誘導足細胞損傷的分子機制可為糖尿病腎病的治療提供一定的新思路。長鏈非編碼（Lnc）RNA 是一類長度超過200 個核苷酸的非編碼RNA、在糖尿病、自身免疫、腫瘤等疾病中發揮重要 調控作 用〔4～6〕。小核仁RNA 宿主基 因（SNHG）14 是近年來在腫瘤中研究較多的一種LncRNA，其參與調控腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學行為〔7～9〕。研究還顯示，SNHG14 與心腦血管疾病、炎癥等發生發展密切相關〔10〕。但目前，SNHG14 在糖尿病腎病中的作用還未知。本研究主要探討SNHG14 對HG 誘導的小鼠腎臟足細胞MPC5 損傷的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑 小鼠腎臟足細胞系MPC5，賽百慷（上海）生物技術股份有限公司；胎牛血清（FBS），浙江天杭生物科技有限公司；D-葡萄糖，美國Gibco公司；LipofectamineTM2000 試劑盒，美國Invitrogen公司；Trizol 試劑、逆轉錄試劑盒和聚合酶鏈反應（PCR）試劑盒，日本Takara 公司；B 細胞淋巴瘤（Bcl）-2、Bcl-2 相關X 蛋白（Bax）和酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）-3 抗體，中國Abcam 公司；nephrin、podocin 和synaptopodin 抗體，美國Maine 公司；SNHG14 的小干擾RNNA（si-NHG14）及過表達載體（pcDNA-SNHG14）、小干擾RNNA 陰性序列（si-NC）、空載體（pcDNA）、miR-16-5p 模擬物（mimic）及抑制劑（anti-miR-16-5p）、模擬對照序列（miR-NC）及抑制劑對照序列（anti-miRNC），上海吉凱基因公司；PCR 引物序列，上海生工生物工程股份有限公司；RPMI1640 培養基、Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒和二喹啉甲酸（BCA）蛋白測定試劑盒，北京索萊寶公司；雙熒光素酶活性檢測試劑盒，美國Promega 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養和轉染 復蘇MPC5 細胞后，用含10% FBS 的RPMI1640 培養基、置于37℃、CO2體積分數5%、濕度97%的培養箱中培養。當細胞融合至80%～90% 時，用0.25% 胰蛋白酶消化，傳代培養。

1.2.2 qRT-PCR 檢測SNHG14 和miR-16-5p 表達 培養結束后，Trizol 試劑提取細胞中總RNA，微量核酸儀檢測RNA 的純度和濃度后，逆轉錄為cDNA。以cDNA 為模板，行PCR 擴增。PCR 擴增程序:95℃5 min，95℃10 s，60℃30 s，72℃30 s，共進行35 個循環。引物序列:SNHG14 上游5＇-GGGTGTTTACGTAGACCAGAACC-3＇，下游5＇-CTTCCAAAAGC CTTCTGCCTTAG-3＇；miR-16-5p 上游5＇-CTCGCTAGCAGCACGTAAATA-3＇，下 游 5＇-TCCAGTGCAGGG TCCGAGGT-3＇；GAPDH 上 游5＇-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3＇，下 游5＇-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3＇；U6 上游5＇-CTCGCTTCGGCAGCACA-3＇，下游5＇-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3＇。SNHG14 以GAPDH 為內參，miR-16-5p 以U6 為內參，用2-ΔΔCt法計算SNHG14 和miR-16-5p 的相對表達量。

1.2.3 雙熒光素酶報告基因實驗驗證SNHG14 與miR-16-5p 靶向關系 取2.5 ml 對數期MPC5 細胞（2.5×104個/ml）接種于6 孔板中，培養12 h 后，棄培養基，換為不含FBS 的RPMI1640 培養基。利用LipofectamineTM2000 試劑盒，分別將miR-16-5p 與WT-SNHG14、miR-NC 與WT-SNHG14、miR-16-5p 與MUT-SNHG14、miR-NC 與MUT-SNHG14 共轉染至MPC5 細胞。分為miR-16-5p+WT-SNHG14 組、miRNC+WT-SNHG14 組、miR-16-5p+MUT-SNHG14 組、miR-NC+MUT-SNHG14 組。轉染后12 h，更換為完全培養基，再培養48 h，棄培養基。加細胞裂解液裂解細胞，4℃、12 000 r/min 離心10 min，取上清液，利用雙熒光素酶活性檢測試劑盒檢測熒光素酶活性，結果以螢火蟲與海參的熒光強度的比值表示。

1.2.4 細胞轉染 取2.5 ml 對數期MPC5 細胞（2.5×104個/ml）接種于6 孔板中，培養24 h 后，棄培養基，換為不含FBS 的RPMI1640 培養基。利用LipofectamineTM2000 試劑盒，分別轉染si-SNHG14、si-NC、pcDNA-SNHG14、pcDNA、miR-16-5p mimics、miR-NC、si-SNHG14+anti-miR-16-5p、si-SNHG14+anti-NC 至MPC5 細胞。轉染后12 h，更換為完全培養基，再培養48 h，qRT-PCR 檢測SNHG14 或miR-16-5p 水平驗證轉染效果，方法同1.2.2，并收集細胞用于后續實驗。

1.2.5 細胞分組處理 取2.5 ml MPC5 細胞或轉染si-SNHG14、si-NC、miR-16-5p mimics、miR-NC、si-SNHG14+anti-miR-16-5p、si-SNHG14 +anti-miR-NC的細胞（2.5×104個/ml）均接種至6 孔板中，培養12 h 后，分組處理。將MPC5 細胞分為對照組（NC組）和HG 組，其中NC 組細胞使用常規培養基培養；HG 組細胞用含30 mmol/L D-葡萄糖的培養基作用24 h。將 轉染si-SNHG14、si-NC、miR-16-5p mimics、miR-NC、si-SNHG14+anti-miR-16-5p、si-SNHG14+anti-miR-NC 的細胞均用含30 mmol/L D-葡萄糖的培養基作用24 h，并分別記為HG+si-SNHG14 組、HG+si-NC 組、HG+miR-16-5p 組、HG+miR-NC 組、HG+si-SNHG14 +anti-miR-16-5p 組 和HG+si-SNHG14+anti-miR-NC 組。培養結束后，收集細胞，采用Western 印跡檢測細胞中nephrin、podocin、synaptopodin、Bax、Bcl-2 和cleaved-caspase-3 蛋白表達，流式細胞術檢測細胞凋亡。轉染si-SNHG14、si-NC、pcDNA-SNHG14、pcDNA、miR-16-5p mimics、miR-NC 的MPC5 細胞分別記為si-SNHG14組、si-NC 組、pcDNA-SNHG14 組、pcDNA 組、miR-16-5p 組、miR-NC 組。

1.2.6 Western 印跡法檢測蛋白表達 取各組處理后的細胞，加 RIPA 裂解液 裂解細 胞，4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，用BCA 法檢測蛋白含量。然后行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），將分離蛋白轉移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，并置于5 %脫脂牛奶中封閉2 h。于4℃冰箱中分別用nephrin、podocin、synaptopodin、Bax、Bcl-2、酶切caspase-3 及GAPDH 一抗孵育過夜，洗膜后，用辣根過氧化酶標記的二抗37℃孵育1 h。加化學發光試劑，避光顯影，凝膠成像系統曝光拍照，Image J 軟件分析目的蛋白相對GAPDH 的表達量。

1.2.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡 取各組處理后的細胞，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗細胞2 次。參照Annexin V-FITC/PI 試劑盒操作說明，取1.0×106個細胞，加500 μl 結合緩沖液，重懸細胞。加10 μl Annexin V-FITC，室溫避光孵育10 min。再加5 μl PI，室溫避光孵育5 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.3 統計學方法 采用SPSS22.0 軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結果

2.1 HG 對小鼠腎臟足細胞MPC5 中SNHG14 和miR-16-5p 表達的影響 HG 組MPC5 細胞中SNHG14 水平顯著高于NG 組（P＜0.05），miR-16-5p水平顯著低于NG 組（P＜0.05）。見表1。

表1 HG 對MPC5 細胞中SNHG14 和miR-16-5p表達的影響(,n=9)

表1 HG 對MPC5 細胞中SNHG14 和miR-16-5p表達的影響(,n=9)

2.2 SNHG14 靶向調控miR-16-5p 的表達 生物信息學軟件預測顯示，SNHG14 的序列中含有與miR-16-5p 互補的核苷酸序列，見圖1。miR-16-5p+WTSNHG14 組MPC5 細胞熒光素酶活性（0.41±0.04）顯著低于共轉染miR-NC 與WT-SNHG14 組（0.98±0.08，t=19.118，P=0.000），而miR-16-5p+MUTSNHG14 組MPC5 細胞熒光素酶活性（1.02±0.08）與miR-NC+MUT-SNHG14 組（1.03±0.09）差異無統計學意義（t=0.249，P=0.806）。pcDNA-SNHG14組MPC5 細胞中miR-16-5p 的表達量（0.38±0.04）顯著低于pcDNA 組（1.00 ±0.08，P＜0.05），si-SNHG14 組MPC5 細胞中miR-16-5p 的表達量高于si-NC 組（0.99±0.09，P＜0.05）。

圖1 SNHG14 的序列中含有與miR-16-5p 互補的核苷酸序列

2.3 抑制SNHG14 對HG 誘導的小鼠腎臟足細胞MPC5 中synaptopodin、nephrin 和podocin 蛋白表達的影響 si-SNHG14 組MPC5 細胞中SNHG14 水平（0.23±0.02）顯著低于si-NC 組（1.02±0.09，t=25.706，P＜0.05），說明si-SNHG14 轉染成功，MPC5細胞中SNHG14 的表達受到抑制。HG 組MPC5 細胞中synaptopodin、nephrin 和podocin 蛋白的表達量顯著低于NG 組（P＜0.05）。HG+si-SNHG14 組MPC5 細胞中synaptopodin、nephrin 和podocin 蛋白的表達量顯著高于HG+si-NC 組（P＜0.05）。見圖2、表2。

圖2 抑制SNHG14 對HG 誘導的MPC5 細胞中synaptopodin、nephrin 和podocin 蛋白表達的影響

表2 抑制SNHG14 表達對HG 誘導的MPC5 細胞中synaptopodin、nephrin 和podocin蛋白表達的影響(,n=9)

表2 抑制SNHG14 表達對HG 誘導的MPC5 細胞中synaptopodin、nephrin 和podocin蛋白表達的影響(,n=9)

與NG 組比較:1）P＜0.05；與HG+si-NC 組比較:2）P＜0.05；下表同

2.4 抑制SNHG14 對HG 誘導的小鼠腎臟足細胞MPC5 凋亡的影響 HG 組MPC5 細胞凋亡率和細胞中Bax、酶切caspase-3 蛋白的表達量均顯著高于NG組（P＜0.05），而Bcl-2 蛋白的表達量顯著低于NG 組（P＜0.05）。HG+si-SNHG14 組MPC5 細胞凋亡率和細胞中Bax、酶切caspase-3 蛋白的表達量均顯著低于HG+si-NC 組（P＜0.05），而Bcl-2 蛋白的表達量顯著高于HG+si-NC 組（P＜0.05）。見圖3，圖4，表3。

表3 抑制SNHG14 高糖誘導的MPC5 細胞凋亡的影響(,n=9)

表3 抑制SNHG14 高糖誘導的MPC5 細胞凋亡的影響(,n=9)

圖3 抑制SNHG14 對HG 誘導的MPC5 細胞中凋亡相關蛋白表達的影響

圖4 抑制SNHG14 HG 誘導的MPC5 細胞凋亡率的影響

2.5 過表達miR-16-5p 對HG 誘導的小鼠腎臟足細胞MPC5 損傷的影響 miR-16-5p 組MPC5 細胞中miR-16-5p 水平（2.28±0.12）顯著高于miR-NC組（1.00±0.05，t=29.538，P＜0.05），說明miR-16-5p mimics 轉染成功，MPC5 細胞中miR-16-5p 過表達。HG+miR-16-5p 組MPC5 細胞中synaptopodin、nephrin 和podocin 蛋白的表達量均顯著高于HG+miR-NC 組（P＜0.05），MPC5 細胞凋亡率和Bax、酶切caspase-3 蛋白的表達量均顯著低于HG+miR-NC組（P＜0.05），Bcl-2 蛋白的表達量顯著高于于HG+miR-NC 組（P＜0.05）。見圖5、表4。

圖5 Western 印跡檢測MPC5 細胞中凋亡相關蛋白及synaptopodin、nephrin 和podocin 蛋白表達的影響

表4 過表達miR-16-5p 對高糖誘導的MPC5 細胞損傷的影響(,n=9)

表4 過表達miR-16-5p 對高糖誘導的MPC5 細胞損傷的影響(,n=9)

2.6 干擾miR-16-5p 逆轉抑制SNHG14 對HG誘導的小鼠腎臟足細胞MPC5 損傷的作用 HG+si-SNHG14+anti-miR-16-5p 組MPC5 細 胞中synaptopodin、nephrin 和podocin 蛋白的表達量均顯著低于HG+si-SNHG14+anti-miR-NC 組（P＜0.05），MPC5 細胞凋亡率和Bax、cleaved-caspase-3 蛋白的表達量均顯著高于HG+si-SNHG14+anti-miR-NC 組（P＜0.05），Bcl-2 蛋白的表達量顯著低于HG+si-SNHG14+anti-miR-NC 組（P＜0.05）。見圖6、表5。

圖6 Western 印跡檢測MPC5 細胞凋亡相關蛋白、synaptopodin、nephrin 和podocin 蛋白表達的作用

表5 干擾miR-16-5p 逆轉抑制SNHG14 對HG 誘導的MPC5 細胞損傷的作用(,n=9)

表5 干擾miR-16-5p 逆轉抑制SNHG14 對HG 誘導的MPC5 細胞損傷的作用(,n=9)

3 討論

糖尿病腎病是導致糖尿病患者死亡的主要原因之一，其發病機制較為復雜，研究認為足細胞損傷在其發生發展中起重要作用〔11〕。HG 是造成足細胞損傷的重要原因之一，可直接損傷足細胞，并誘導足細胞凋亡。足細胞裂隙膜蛋白nephrin、podocin 和骨架蛋白synaptopodin 參與足細胞損傷〔12〕。本研究結果表明HG 環境下，基底膜蛋白受損，足細胞屏障破壞障礙。Bax/Bcl-2 參與調控細胞凋亡，Bax 表達升高可促進細胞凋亡，而Bcl-2 作用與Bax 相反，表達升高抑制細胞凋亡。Caspases 介導的級聯反應在細胞凋亡中發揮關鍵調節作用，caspase-3 是caspases級聯反應核心分子，被活化后執行細胞凋亡〔13，14〕。本研究結果說明HG 誘導促進了MPC5 細胞凋亡，與相關報道結果一致。

研究發現，SNHG14 參與腦卒中、腫瘤等疾病的發生和發展〔15〕。Cao 等〔16〕研究顯示，抑制SNHG14表達可抑制脂多糖誘導的原代神經元凋亡和caspase-3 活性升高。本研究結果提示SNHG14 參與足細胞損傷過程；與SNHG14 表達未被抑制的MPC5 細胞相比，SNHG14 表達抑制的MPC5 細胞被HG 誘導后，細胞中nephrin、podocin 和synaptopodin蛋白表達水平顯著升高，表明抑制SNHG14 表達可降低足細胞損傷，改善足細胞屏障破壞障礙；抑制SNHG14 表達可降低HG 誘導的MPC5 細胞凋亡。

研究顯示，miR-16-5p 與糖尿病、胰島素抵抗等密切相關，在糖尿病的發展過程中起重要作用〔17，18〕。張琳等〔19〕研究顯示，糖尿病腎病患者血清中miR-16-5p 表達水平降低，且與患者病情嚴重程度密切相關。但目前，miR-16-5p 對腎臟足細胞損傷及凋亡的影響還未知。本研究結果說明miR-16-5p 對HG 誘導的MPC5 細胞損傷發揮保護作用；抑制SNHG14 表達通過上調miR-16-5p 表達進而保護HG 誘導的MPC5 細胞損傷及抑制其凋亡。