右美托咪定對尿液干細(xì)胞移植治療大鼠肺氣腫的影響

張茂 康學(xué)棟 劉穎 朱鴻浩

（1 宜賓市第一人民醫(yī)院藥劑科,四川 宜賓 644000;2 暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科）

肺氣腫是慢性阻塞性肺疾病的晚期表現(xiàn)，并無特效治療方法，故嚴(yán)重威脅人們的生命安全〔1，2〕。臨床上多以低流量吸氧、中藥治療、激素注射或者抗感染等針對其癥狀緩解的治療方法為主〔3〕。然而因肺氣腫引發(fā)的肺部組織結(jié)構(gòu)損傷和功能下降，目前的治療手段并無良好的效果。干細(xì)胞是一類可以高度增殖并具有極佳的分化分泌功能的多向性分化細(xì)胞，其在組織損傷修復(fù)方面表現(xiàn)良好〔4～6〕。其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和胎肝干細(xì)胞等由于來源受限且具有倫理學(xué)的爭議，研究受到限制。而尿液干細(xì)胞來源廣泛且無此爭議，因此其研究廣泛而深入〔7，8〕。研究顯示尿液干細(xì)胞可以修復(fù)表皮、臟器等組織損傷，其是一種未來治療組織損傷的明星細(xì)胞〔9，10〕。王晨等〔11〕研究表明，尿液細(xì)胞來源的人類誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞可以向肺泡上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化，具有修復(fù)肺臟損傷的潛力。右美托咪定是臨床上較為常用的麻醉藥物，其是高選擇性的α2 腎上腺素受體激動劑〔12〕；其可以通過激動α2 腎上腺素受體，對患者發(fā)揮鎮(zhèn)痛和抑制焦慮的作用〔13〕。右美托咪定在緩解患者的病痛過程，其并無抑制呼吸的作用，這促使其可以廣泛應(yīng)用于肺部疾病的治療，同時趙津津等〔14〕研究表明右美托咪定通過抑制肺損傷引起的核轉(zhuǎn)錄因子（NF）-κB、轉(zhuǎn)錄激活子（STAT）-3 通路的激活進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)最終起到肺保護(hù)作用，故其對肺氣腫有保護(hù)作用。然而目前的研究就右美托咪定聯(lián)合尿液干細(xì)胞移植對肺氣腫的影響研究較少；本研究旨在探討右美托咪定對尿液干細(xì)胞移植治療肺氣腫模型大鼠的影響。

1 實驗及材料

1.1 材料及來源 L-DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清和磷酸鹽緩沖液（PBS）均購自Hyclone 公司；Trizol 試劑盒購自Invitrogen 公司；轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及胰島素樣生長因子（IGF）-Ⅰ兔IgG 多克隆抗體均購自Santa anta Gruz公司；兔抗大鼠多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 均購自英國Abcam 公司；胰蛋白酶、RT-聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司；本實驗所用引物均由Invitrogen 公司合成提供。鹽酸右美托咪定注射液（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)）；68 只體重為180～210 g 的成年雌性Wistar 大鼠（7 周齡）由北京維通利華動物實驗技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號:SCXK（川）2014-0021，實驗動物使用許可證號:SYXK（川）2015-0023）2014-0012。所有Wistar 大鼠飼養(yǎng)于室溫25℃，濕度60%～70%的SPF 環(huán)境下，同時給予大鼠以自由方便的飲水和采食。人尿液干細(xì)胞購自上海通派生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 尿液干細(xì)胞培養(yǎng)和標(biāo)記 取出液氮保存的人尿液干細(xì)胞，復(fù)蘇接種于一次性細(xì)胞培養(yǎng)瓶（25 cm2）中，加入DMEM 培養(yǎng)液5 ml，放入37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)5%CO2培養(yǎng)，每隔2 d 換液1 次。連續(xù)傳代3 次后，離心去掉上清，將尿液干細(xì)胞密度調(diào)整為1×106/ml。將細(xì)胞放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)7 d，用PBS 洗滌細(xì)胞3 次后棄去上清液。隨后行干細(xì)胞進(jìn)CFSE 的熒光標(biāo)記。向細(xì)胞懸液中加入CFSE，DMEM 培養(yǎng)液調(diào)整其濃度5 μmol/L，隨后將標(biāo)記的細(xì)胞不斷搖勻轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)放置15 min，在熒光顯微鏡下觀測CFSE 標(biāo)記的尿液干細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)。

1.2.2 動物模型建立和實驗分組 68 只Wistar 雌性大鼠給予刺激處理以構(gòu)建肺氣腫模型，其處理操作如下:將大鼠放置在60 L 封閉玻璃箱中，并在玻璃箱中放入16 支點燃的香煙給予大鼠煙熏30 min，2 次/d，每次間隔6 h。在處理1 個月后麻醉大鼠，采用氣管插管向大鼠氣管中滴入豬胰彈生蛋白酶；隨后采用小動物呼吸機(jī)給予大鼠通氣并將大鼠直立旋轉(zhuǎn)使豬胰彈生蛋白酶均勻進(jìn)入大鼠兩側(cè)的肺組織。隨后拔出大鼠的插管，繼續(xù)給予所有大鼠以煙熏處理，連續(xù)進(jìn)行2 個月從而構(gòu)建大鼠肺氣腫模型。造模完成后隨機(jī)取8 只大鼠，取肺組織行蘇木素-伊紅（HE）染色可見建模成功。60 只大鼠隨機(jī)分為4個，每組20 只:給予病理對照組0.5 ml 的L-DMEM完全培養(yǎng)液尾靜脈注射，給予尿液干細(xì)胞組0.5 ml的5×106個/L 的尿液干細(xì)胞尾靜脈移植，給予右美托咪定組大鼠尾靜脈6 h 持續(xù)輸入5 μg/（kg·h）的右美托咪定，給予聯(lián)合治療組大鼠尾靜脈注射尿液干細(xì) 胞〔0.5 ml，5 × 106個/L〕 和右美 托咪定〔5 mg（kg·h），6 h/d〕。所有操作連續(xù)進(jìn)行3 d。

1.2.3 肺泡灌洗液TGF-β1、VEGF 及IGF-Ⅰ表達(dá)水平 治療6 w 后，從4 組中隨機(jī)選出5 只大鼠收集其肺泡灌洗液；將大鼠的肺臟舌葉作為灌洗部位以獲取BALF 細(xì)胞，所有操作參照BALF 相關(guān)的指針進(jìn)行。收集4 組肺泡灌洗液后，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定各組肺泡灌洗液中TGF-β1、VEGF 及IGF-Ⅰ表達(dá)水平并進(jìn)行比較。

1.2.4 肺組織TGF-β1、VEGF 及IGF-Ⅰ基因表達(dá)水平 治療6 w 后，從4 組中分別隨機(jī)選出5 只大鼠采集大鼠的肺臟50 mg，RT-PCR 檢測大鼠肺臟組織TGF-β1、VEGF 及IGF-Ⅰ表達(dá)水平。將冷凍的肺臟組織進(jìn)行冰凍研磨后向組織液中加入Trizol 試劑裂解細(xì)胞并提取細(xì)胞中RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄說明合成并擴(kuò)增相應(yīng)cDNA。擴(kuò)增條件均為94℃預(yù)變性1 min，94℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，共33 個循環(huán)。TGF-β1:上游引物:5＇-GCTAATGGTGGACCGCAAC-3＇；下游引 物:5＇-GCTAATGGTGGACCGCAAC-3＇ ；IGF-Ⅰ:上游引游5＇-GCATTGTGGATGAGTGTTGC-3＇；下游引物:5＇-GGCTCCTCCTACATTCTGTA-3＇；VEGF:上游引 物:5＇-GCTATTGCCGTCCAATTGAG-3；下游引物:5＇-GGTTTGATCCGCATGATCTG-3＇；β-actin:上游引 物:5＇-CTGCCGCATCCTCTTCCTC-3＇ ；下游引物:5＇-GCAGTAATCTCCTTCTGCATCC-3＇ 。以β-actin 基因作為內(nèi)參，測定4 組IGF-ⅠmRNA、VEGF 及IGF-ⅠmRNA 在肺組織相對表達(dá)水平。

1.2.5 肺組織TGF-β1、VEGF 及IGF-Ⅰ蛋白表達(dá)水平 將RT-PCR 提取后剩余物按1 500 r/min 離心30 min，取上清為粗體蛋白，根據(jù)二喹啉甲酸（BCA）試劑盒（北京益德益華生物有限公司）提取并測定肺組織蛋白濃度，將細(xì)胞裂解并將其稀釋至相同的蛋白濃度，100℃煮沸5 min 使蛋白變性。每組取蛋白40 μg，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電 泳（SDS-PAGE，70 V，30 min；100 V，90 min）；轉(zhuǎn)膜（200 mA，3 h）至聚偏氟乙烯（PVDF）膜；5%脫脂牛奶室溫封閉2 h（或4℃過夜）；一抗1 ∶500，室溫孵育2 h（或4℃過夜）；TPBS 洗滌3 次，PBS 洗滌1 次；之后進(jìn)行Western 印跡檢測，拍照記錄之后進(jìn)行軟件的圖像分析，測定各組肺纖維化損傷組織中TGF-β1、VEGF 及IGF-Ⅰ蛋白質(zhì)相對表達(dá)水平。

1.2.6 肺組織病理學(xué)變化 干預(yù)6 w 后從4 組中隨機(jī)選取5 只大鼠，分別采集大鼠的肺臟組織并進(jìn)行HE 染色進(jìn)行大鼠肺組織的病理學(xué)檢測。首先采用甲醛溶液對肺臟組織進(jìn)行組織固定，采用不同濃度的酒精分別進(jìn)行自低濃度到高濃度的酒精脫水處理。脫水操作完成后將肺臟組織塊放置于二甲苯中進(jìn)行透明處理，將組織中的酒精全部替換而出；浸蠟包埋，將蠟塊在切片機(jī)上切成5～8 μm 厚的肺組織薄片。小心將所有肺組織薄片進(jìn)行熨平后貼在載玻片上低溫烘干脫蠟。脫蠟后進(jìn)行HE 染色，之后分別經(jīng)過酒精脫水和二甲苯透明處理后，在切片上滴加加拿大樹膠封上蓋玻片。樹膠干燥后，在熒光顯微鏡下檢測4 組大鼠肝臟組織病理學(xué)的形態(tài)和變化。

1.2.7 尿液干細(xì)胞在肺組織中的存活和分布 干預(yù)6 w 后從4 組中隨機(jī)選取5 只大鼠，分別采集大鼠的肺臟組織，并將之制備成冷凍切片并進(jìn)行4＇，6-二脒基-2 苯基吲哚染色。熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，在鏡下視野中隨機(jī)選取3 個視野拍照記錄；假設(shè)每張照片的總亮度為1，從各張照片之中選取1 個亮點，使用ACDsee5.0 軟件確定其坐標(biāo)。從各個樣本的圖像之中選取8 個視野，分別計數(shù)視野中CFSE標(biāo)記的陽性細(xì)胞數(shù)和尿液干細(xì)胞總數(shù)，計算得出各組中大鼠肺臟組織中的尿液干細(xì)胞標(biāo)記率。

1.2.8 肺泡壁細(xì)胞凋亡率 干預(yù)6 w 后從4 組中隨機(jī)選取5 只大鼠，取大鼠的肺葉制作石蠟切片，滴加復(fù)合消化酶在切片上進(jìn)行20 min 的室溫消化；洗滌切片，向其中滴加50 μl 的Tunel 標(biāo)記反應(yīng)混合液37℃下進(jìn)行孵育1 h；之后滴加50 μl 的POD2 轉(zhuǎn)化液，在37℃下繼續(xù)孵育30 min；用PBS 沖洗4 次后用DBA 顯色，在熒光顯微鏡下觀察各組肺泡壁上的凋亡細(xì)胞數(shù)目并計算肺泡壁上細(xì)胞的凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0 軟件進(jìn)行t檢驗、多組間單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 尿液干細(xì)胞形態(tài)及CFSE 標(biāo)記 將尿液干細(xì)胞體外條件下復(fù)蘇完成6 h 后，可以在顯微鏡下見到少量的干細(xì)胞已經(jīng)開始附著于培養(yǎng)皿的壁和底部。將尿液干細(xì)胞接種在細(xì)胞培養(yǎng)皿上24 h 后的干細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞貼在細(xì)胞培養(yǎng)皿上逐漸開始生長，顯微鏡下可見尿液干細(xì)胞逐漸呈現(xiàn)出長梭形或三角形。見圖1。經(jīng)過CFSE 標(biāo)記的尿液干細(xì)胞，熒光顯微鏡下可見綠色熒光，尿液干細(xì)胞24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h 存活率（0.23±0.03、0.30±0.04、0.39±0.05、0.46±0.03、0.58±0.06、0.71±0.05，均P＜0.05）依次上升。

圖1 尿液干細(xì)胞形態(tài)及CFSE 標(biāo)記觀察(×40)

2.2 各組肺泡灌洗液TGF-β1、VEGF 及IGF-Ⅰ表達(dá)水平比較 病理對照組肺泡灌洗TGF-β1、VEGF及IGF-Ⅰ的濃度最高（P＜0.05），與之相比，其余各組以上指示水平均顯著下降（均P＜0.05）且聯(lián)合治療組以上指標(biāo)水平濃度最低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組肺泡灌洗液TGF-β1、VEGF 及IGF-Ⅰ表達(dá)水平比較(,n=5,μg/L)

表1 各組肺泡灌洗液TGF-β1、VEGF 及IGF-Ⅰ表達(dá)水平比較(,n=5,μg/L)

與病理對照組比較:1）P＜0.05，與 聯(lián)合治療組比較:2）P＜0.05；下表同

2.3 各組肺組織TGF-β1、VEGF 及IGF-Ⅰ基因表達(dá)水平比較 病理對照組肺組織TGF-β1、VEGF 及IGF-1 濃度最高（P＜0.05），與之相比，其余各組以上指標(biāo)水平均顯著下降，且聯(lián)合治療組以上指標(biāo)水平濃度最低（均P＜0.05）。見表2，圖2。

表2 各組肺組織TGF-β1、VEGF 及IGF-Ⅰ基因表達(dá)水平比較(,n=5)

表2 各組肺組織TGF-β1、VEGF 及IGF-Ⅰ基因表達(dá)水平比較(,n=5)

圖2 肺組織TGF-β1、VEGF 及IGF-Ⅰ基因表達(dá)水平

2.4 各組肺組織TGF-β1、VEGF 及IGF-Ⅰ蛋白表達(dá)水平比較 病理對照組中大鼠肺臟組織TGF-β1、VEGF 及IGF-Ⅰ蛋白相對表達(dá)水平最高（P＜0.05）；與之相比，其余各組以上指標(biāo)水平均顯著下降，且聯(lián)合治療組以上指標(biāo)水平濃度最低（均P＜0.05）。見圖3，表3。

圖3 Western 印跡檢測肺組織TGF-β1、VEGF 及IGF-Ⅰ蛋白的表達(dá)

表3 各組肺組織TGF-β1、VEGF 及IGF-Ⅰ蛋白表達(dá)水平比較(,n=5)

表3 各組肺組織TGF-β1、VEGF 及IGF-Ⅰ蛋白表達(dá)水平比較(,n=5)

2.5 肺組織病理學(xué)變化 各組肺臟中均出現(xiàn)了不同程度的肺氣腫。病理對照組肺組織中有較為明顯的充血，肺泡中有明顯的纖維性浸潤且可見肺泡的內(nèi)襯間隔較厚。尿液干細(xì)胞組和右美托咪定組肺氣腫顯著緩解，可見肺泡內(nèi)襯間隔顯著變薄，充血及纖維性浸潤明細(xì)減輕；與尿液干細(xì)胞組和右美托咪定組相比，聯(lián)合治療組肺氣腫肺臟組織病理學(xué)變化明顯改善。見圖4。

圖4 各組肺組織病理學(xué)變化(HE,×40)

2.6 尿液干細(xì)胞在肺組織中的存活和分布 病理對照組和右美托咪定組中未見有CFSE 標(biāo)記的尿液干細(xì)胞；而在尿液干細(xì)胞組和聯(lián)合治療組中可以見到有較多的CFSE 標(biāo)記的尿液干細(xì)胞存在。且聯(lián)合治療組中的尿液干細(xì)胞數(shù)目〔（47.42 ±5.63）個/Hp〕顯著多于尿液干細(xì)胞組〔（31.58±4.24）個/Hp，P＜0.05〕。見圖5。

圖5 各組熒光顯微鏡觀察CFSE 標(biāo)記尿液干細(xì)胞分布(CFSE,×200)

2.7 肺泡壁細(xì)胞凋亡率 病理對照組肺組織中肺泡壁上的細(xì)胞凋亡率最高〔（47.10±2.27）%〕，與之相比，右美托咪定組〔（25.53±1.12）%〕和尿液干細(xì)胞組〔（26.55±1.14）%〕細(xì)胞凋亡率顯著下降（均P＜0.05）；聯(lián)合治療組肺泡壁細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步下降〔（14.92±0.85）%，P＜0.05〕。見圖6。

圖6 各組肺泡壁細(xì)胞凋亡(Tunel,×100)

3 討論

長期吸煙和慢性炎癥反應(yīng)均會導(dǎo)致肺氣腫〔15，16〕。本研究通過煙熏和氣管內(nèi)滴入豬胰彈生蛋白酶的方法成功構(gòu)建了大鼠肺氣腫病理模型。研究顯示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等多向分化細(xì)胞移植在緩解肺氣腫癥狀表現(xiàn)優(yōu)異〔17，18〕。尿液干細(xì)胞具有修復(fù)腎臟、骨骼和神經(jīng)損傷的作用〔19，20〕。右美托咪定是臨床上常用的鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛劑，研究發(fā)現(xiàn)其對多種干細(xì)胞均有促進(jìn)增殖和誘導(dǎo)分化的作用〔21，22〕。

本研究結(jié)果表明單獨治療作用顯著改善了肺氣腫大鼠的肺臟組織形態(tài)學(xué)，緩解因損傷造成的細(xì)胞凋亡。右美托咪定是臨床上常用的鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛劑，能夠通過抑制肺損傷引起的NF-κB、STAT-3 通路的激活進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)最終起到肺保護(hù)作用，故其對肺氣腫有保護(hù)作用，改善肺部微環(huán)境，為尿液干細(xì)胞移植后發(fā)揮作用提供有利條件，同時研究發(fā)現(xiàn)其對多種干細(xì)胞均有促進(jìn)增殖和誘導(dǎo)分化的作用，右美托咪定同時可能緩解并減輕肺部損傷，其通過影響肺部血管收縮和抑制炎癥等改善肺部損傷〔23，24〕。尿液干細(xì)胞則可能具有向損傷部位歸巢并向正常肺臟細(xì)胞轉(zhuǎn)化的特性，進(jìn)而提高肺部損傷的修復(fù)效果。本研究結(jié)果表明，右美托咪定可能具有提高尿液干細(xì)胞增殖和活化的作用。這與右美托咪定在體外誘導(dǎo)干細(xì)胞增殖活化的作用較為相似，有待進(jìn)一步研究探討。

TGF-β1 具有調(diào)節(jié)細(xì)胞分化生長的功能，而該分子還具有極強的膠原合成促進(jìn)作用，并可以抑制成纖維細(xì)胞的凋亡〔25〕。因此該分子在肺部纖維化和損傷進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用。而IGF-1 和TGF-β1在誘導(dǎo)肺部損傷和纖維化進(jìn)程中具有協(xié)同作用〔26～30〕。研究表明，VEGF 在肺部纖維化和肺氣腫進(jìn)程發(fā)揮著促進(jìn)作用〔31〕。本研究顯示尿液干細(xì)胞移植和右美托咪定輸注聯(lián)合顯著降低肺組織和肺泡灌注液中TGF-β1、VEGF 及IGF-Ⅰ的表達(dá)水平，這可能是該聯(lián)合作用改善肺氣腫的機(jī)制之一。

TGF-β1 有多種生物學(xué)效應(yīng)，不僅對巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等有很強的趨化作用，同時還能刺激腫瘤壞死因子（TNF）-α，白細(xì)胞介素（IL）-6，IL-1β 等炎性細(xì)胞因子釋放導(dǎo)致肺損傷進(jìn)展，故降低TGF-β1 能夠減輕肺損傷〔32〕。研究表明VEGF 持續(xù)高表達(dá)與大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷有關(guān)，而血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷可能是誘發(fā)大鼠肺纖維化的重要啟動因素之一〔33〕，本研究表明大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷減輕，抑制血管新生，發(fā)揮抗肺纖維化作用。IGF-Ⅰ在肺氣腫肺纖維化過程中起促進(jìn)作用。