長鏈非編碼RNA PRNCR1 通過靶向miR-126-5p 調控非小細胞肺癌增殖、遷移、侵襲的生物學特性

張萌 崔姚 李穎璐 王建新 吳宇翔 時沛

（南陽醫學高等?？茖W校第一附屬醫院腫瘤科,河南 南陽 473000）

肺癌的發病率和死亡率在世界上均居首位，主要包括小細胞肺癌和非小細胞肺癌，其中80%以上為非小細胞肺癌〔1～3〕。臨床上大部分患者確診時已至ⅢB 和Ⅳ期，失去最佳治療時機。長度超過200個核苷酸的LncRNA 及19～25 核苷酸的miRNA 為非編碼RNA 的重要組成部分〔4～6〕。LncRNA 在人類腫瘤的調控中可通過多途徑發揮作用，包括調節miRNA〔7，8〕。前列腺癌非編碼RNA（PRNCR）1 位于染色體8q24，最早發現于前列腺癌〔9〕。少有研究報道PRNCR1 在非小細胞肺癌中的功能與機制。生物學預測出miR-126-5p 可能是PRNCR1 的靶標，而miR-126-5p 被報道在非小細胞肺癌組織和細胞系中低表達〔10〕。因此，本研究對PRNCR1、miR-126-5p在非小細胞肺癌細胞H1299 內的表達進行檢測，并觀察二者在H1299 細胞增殖、遷移和侵襲中的作用，揭示PRNCR1 的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 H1299 細胞、正常人支氣管上皮細胞HBE 購自美國組織培養庫（ATCC）；DMEM 培養基、四甲基偶氮唑藍（MTT）購自美國Gibco 公司；LipofectamineTM2000、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒、逆轉錄試劑盒購自大連寶生物工程公司；聚偏氟乙烯（PVDF）膜購自德國Roche Diagnostics 公司；基質膠購自上海前塵生物公司；Transwell 小室購自美國Corning 公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰膠凝膠電泳（SDS-PAGE）試劑盒、電化學（ECL）發光液和RIPA 蛋白裂解液均購自江蘇Beyotime Biotechnology公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 在37℃和5%CO2的恒溫培養箱中，將非小細胞肺癌細胞H1299、正常人支氣管上皮細胞HBE 與DMEM 培養基（10%胎牛血清）一起常規孵育。

1.2.2 細胞轉染 將si-con 組（轉染si-con）、si-PRNCR1 組（轉染si-PRNCR1）、miR-130b-3p 組（轉染miR-130b-3p mimics）、miR-NC 組（轉染miRNC）、si-PRNCR1+anti-miR-NC 組（共轉染si-PRNCR1 和anti-miR-NC）、si-PRNCR1+anti-miR-126-5p組（共轉染si-PRNCR1 和anti-miR-126-5p），通過脂質體LipofectamineTM2000 試劑轉染至H1299 細胞，采用實時熒光定量-聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測轉染48 h 后的效率。

1.2.3 qRT-PCR 實驗 應用RNA 抽提試劑盒，提取1.2.2 各組H1299 細胞RNA，并通過逆轉錄試劑盒進行cDNA 制備。最后通過qRT-PCR 試劑盒檢測，采用2-△△Ct計算PRNCR1 和miR-126-5p 表達。

1.2.4 MTT 實驗 將1.2.2 各組H1299 細胞與20 μl 5 g/L 的MTT 溶液反應4 h，以DMSO 溶解結晶，隨后酶標儀記錄 H1299 細胞的吸光度（OD490 nm）。

1.2.5 Transwell 小室 以無血清DMEM 培養基稀釋1.2.2 各組H1299 細胞（105個/ml），在鋪適量厚度的基質膠（檢測侵襲）或不鋪基質膠（檢測遷移）的Transwell 上室添加100 μl H1299 細胞，下室添加600 μl含血清的DMEM 培養基，12 h 后取出小室，經甲醇固定30 min 和0.1%結晶紫染色20 min，將Transwell 小室下表面附著的侵襲或遷移細胞數于顯微鏡下觀察，以5 個視野的平均值為侵襲或侵襲細胞數。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因檢測實驗PRNCR1 和miR-126-5p 構建野生型（WT）-PRNCR1（含PRNCR1 3＇UTR 片段）和突變型（MUT）-PRNCR1（含PRNCR1 3＇UTR 片段突變體）的熒光素酶報告載體，遵循LipofectamineTM2000 操作手冊的指示，H1299細胞轉染miR-126-5p、miR-NC 和WT-PRNCR1 記為miR-126-5p 組，H1299 細胞轉染miR-126-5p、miRNC 和MUT-PRNCR1 記為miR-NC 組；利用美國Promega 公司的雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒，記錄轉染24 h 后的螢火蟲和海腎熒光素酶激發值，以螢火蟲與海腎熒光素酶激發值之比評價PRNCR1 基因的激活程度。

1.3 統計學方法 采用SPSS21.0 軟件進行單因素方差分析、t檢驗和SNK-q檢驗。

2 結果

2.1 PRNCR1 和miR-126-5p 在H1299 細胞和HBE細胞中的表達 H1299 組PRNCR1 表達水平（2.79±0.18）顯著高于HBE 組（1.01±0.09，P＜0.05），H1299 組miR-126-5p 表達水 平（1.07 ±0.12）顯著低于HBE 組（3.12±0.27，P＜0.05）。

2.2 抑制PRNCR1 表達對非小細胞肺癌H1299 細胞增殖的影響 si-PRNCR1 組H1299 細胞中PRNCR1 表達水平顯著低于si-NC 組（P＜0.05），且48 h和72 h 時細胞活性顯著低于si-NC 組（P＜0.05）。見表1。

表1 抑制PRNCR1 表達對非小細胞肺癌H1299細胞增殖的影響(,n=3)

表1 抑制PRNCR1 表達對非小細胞肺癌H1299細胞增殖的影響(,n=3)

圖1 非小細胞肺癌H1299 細胞遷移、侵襲(結晶紫染色,×200)

2.3 抑制PRNCR1 表達對非小細胞肺癌H1299 細胞遷移、侵襲的影響 與si-NC 組相比，si-PRNCR1組H1299 細胞的遷移細胞數和侵襲細胞數均顯著降低（P＜0.05）。見表2。

表2 抑制PRNCR1 表達對非小細胞肺癌H1299 細胞遷移、侵襲的影響(,n=3,個)

表2 抑制PRNCR1 表達對非小細胞肺癌H1299 細胞遷移、侵襲的影響(,n=3,個)

2.4 miR-126-5p 過表達對非小細胞肺癌H1299 細胞增殖、遷移、侵襲的影響 miR-126-5p 組H1299細胞中miR-126-5p 表達水平顯著高于miR-NC 組（P＜0.05），48 h、72 h 時細胞活性、遷移細胞數和侵襲 細胞數均顯著低于miR-NC 組（P＜0.05）。見表3。

表3 miR-126-5p 過表達對非小細胞肺癌H1299 細胞增殖、遷移、侵襲的影響(,n=3)

表3 miR-126-5p 過表達對非小細胞肺癌H1299 細胞增殖、遷移、侵襲的影響(,n=3)

2.5 PRNCR1 靶向調控miR-126-5p 的表達 miRcode 數據庫預測結果見圖2，PRNCR1 3＇UTR 部分核苷酸序列可與miR-126-5p 互補配對；miR-15a 組WT-PRNCR1 熒光活性比miR-NC 組顯著降低（P＜0.05），轉染miR-15a 或miR-NC 對MUT-PRNCR1細胞中熒光活性無顯著影響（P＞0.05）。見表4。si-PRNCR1 組細胞中miR-126-5p 表達（2.77±0.23）是si-NC 組（1.04±0.09）的約1.66 倍，pcDNA-PRNCR1 組細胞中miR-126-5p 表達（0.53±0.06）是pcDNA 組（1.12±0.11）的約0.47 倍，均有統計學意義（P＜0.05）。

表4 雙熒光素酶報告實驗(,n=3)

表4 雙熒光素酶報告實驗(,n=3)

圖2 PRNCR1 的3′UTR 中含有與miR-126-5p 互補的核苷酸序列

2.6 抑制miR-126-5p 表達逆轉了抑制PRNCR1 表達對非小細胞肺癌H1299 細胞增殖、遷移、侵襲的作用 si-PRNCR1+anti-miR-126-5p 組48、72 h 時細胞活性、遷移細胞數和侵襲細胞數顯著高于si-PRNCR1+anti-miR-NC 組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表5。

表5 抑制miR-126-5p 表達逆轉了抑制PRNCR1 表達對非小細胞肺癌H1299 細胞增殖、遷移、侵襲的作用(,n=3)

表5 抑制miR-126-5p 表達逆轉了抑制PRNCR1 表達對非小細胞肺癌H1299 細胞增殖、遷移、侵襲的作用(,n=3)

3 討論

LncRNA 與miRNA 之間的相互作用關系在腫瘤的發生發展中發揮關鍵作用。Chung 等〔11〕報道，rs1456315 和rs7463708 之間（chr8:128，173，119～128，173，237 bp）區域被轉錄為13 kb 無內含子非編碼RNA（ncRNA），稱為PRNCR1（前列腺癌非編碼RNA1）。Yang 等〔12〕發現，PRNCR1 在大多數結直腸癌細胞中上調，敲低PRNCR1 后，結直腸癌細胞增殖能力被顯著抑制，進一步發現PRNCR1 敲低誘導細胞周期停滯在G0/G1 期且S 期細胞比例顯著降低，相反，PRNCR1 敲低不影響細胞凋亡或侵襲能力，這些數據表明PRNCR1 促進結直腸癌細胞的增殖，且是結直腸癌的潛在致癌基因。Dezhi 等〔13〕發現，miR-448 在非小細胞肺癌組織和細胞中表達升高，通過抑制細胞增殖、侵襲、遷移和上皮-間質轉化（EMT）揭示了miR-448 在非小細胞肺癌中的抗癌基因功能，發現miR-448 被LncRNA PRNCR1 負調節，此外，HEY2（與YRPW 基序蛋白2 分開相關的毛發和增強子）被證明是非小細胞肺癌細胞中miR-448 的靶mRNA，所有機制實驗均顯示LncRNA PRNCR1 通過調節miR-448 和HEY2 在非小細胞肺癌中發揮ceRNA 功能。

研究報道，miR-126 在各種肺癌中均發揮抑癌基因的作用，尤其非小細胞肺癌〔14～16〕。Liu 等〔17〕報道，miR-126-3p 在非小細胞肺癌細胞系和組織中顯著下調，miR-126-3p 的上調抑制了非小細胞肺癌細胞的生長、集落形成、遷移和侵襲，此外，異種移植模型表明miR-126-3p 通過靶向趨化因子（C-C 基序）受體（CCR）1 抑制非小細胞肺癌細胞生長和肺轉移，又證實了CCR1 過表達挽救了miR-126-3p 對非小細胞肺癌細胞生長，遷移和侵襲的抑制作用，最后，CCR1 的敲除能夠模擬miR-126-3p 對非小細胞肺癌細胞進展的抑制作用，表明miR-126-3p 通過靶向CCR1 在非小細胞肺癌的生長、遷移和侵襲中起重要作用。