蘿卜硫素通過Notch 通路抑制結腸癌SW480 細胞增殖、侵襲、遷移

邢明遠 賴志亨 馬萌

（海南省中醫院 1 腫瘤科,海南 海口 570203;2 肛腸科;3 陜西中醫藥大學附屬醫院腫瘤科）

結腸癌原發于結腸黏膜上皮，惡性程度高，其是消化系統常見的惡性腫瘤，也是臨床上癌癥相關死亡的主要原因，且近幾年隨著我國經濟的迅速發展，快節奏的生活方式和不良的生活習慣，導致結腸癌的發病率逐年提高，嚴重威脅人們的生命健康〔1～3〕。隨著對中醫學的深入研究，發現中醫在臨床治療腫瘤中發揮重要作用，為臨床上治療腫瘤擴展了新思路。蘿卜硫素又稱為菜菔子素，作為提取于十字花科蔬菜中的一種異硫氰酸酯類天然活性物質，其能夠誘導產生Ⅱ型解毒酶，從而調控癌細胞生物學進程，防止乳腺癌等擴散與蔓延〔4〕。Notch 信號通路在癌癥中受到廣泛關注，其能夠調控Hes1 等下游因子表達進而介導細胞增殖、凋亡等生理病理過程〔5〕。研究發現，Notch 信號通路與結腸癌的發生發展密切相關〔6〕，其中Notch1 在人結腸癌組織中呈高表達，結腸癌SW480 細胞增殖受抑制同時，Notch1、Hes1 mRNA 和蛋白表達水平亦顯著下調〔7〕。此外，楊正宏等〔8〕研究發現蘿卜硫素能抑制結腸癌HT-29 細胞增殖、血管形成并促進細胞凋亡，可能與抑制Notch1 表達有關。本研究將以結腸癌SW480 細胞為研究對象，基于Notch 信號通路探究蘿卜硫素對SW480 細胞增殖、侵襲、遷移的影響，以期為結腸癌治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器 人結腸癌SW480 細胞（貨號:C4115，美國ATCC 公司），蘿卜硫素（≥98%，貨號:BP0219，成都格純生物醫藥有限公司），胰酶溶液（貨號:C0201，杭州碧云天生物研究所），胎牛血清（FBS）、RPMI1640 培養基、四甲基偶氮唑藍（MTT）試劑（貨號:KL-NXQ05、KL-S764、KL-S0050，上海康朗生物科技有限公司），兔抗人Notch1、Notch3、Hes1、β-actin 抗 體（貨 號:K10957-JRY、K21355-RPK、K17548-MTX、K10085-OZI，北京百奧萊博科技有限公司），兔抗人Ki-67、增殖細胞核抗原（PCNA）、基質金屬蛋白酶（MMP）-9、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）抗體（貨號:FNab09788、FNab06217、FNab05247、FNab10112，武漢菲恩生物科技有限公司），山羊抗兔IgG（H+L）辣根過氧化物酶（HRP）（貨號:BM3894，武漢博士德生物工程有限公司）。CO2培養箱（型號:INC108，德國Heraeus 公司），流式細胞儀（型號:FACSCanto Ⅱ，美國BD 公司），蛋白電泳及電轉移裝置（型號:AU5800，北京市六一儀器廠），酶聯免疫分析儀（型號:EVO75，澳大利亞Techan 公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 將人結腸癌SW480 細胞接種于RPMI1640 培養液（RPMI1640 培養基中添加1%青鏈霉素雙抗和10% FBS）中，在37℃、5% CO2、98%相對濕度的培養箱中常規培養。觀察細胞狀態，當細胞的融合度達70%～80%時，胰酶溶液消化傳代，收集對數期細胞進行后續實驗。

1.2.2 MTT 比色法篩選蘿卜硫素對SW480 細胞的作用濃度 SW480 細胞密度調整為5×104個/ml，隨后以每孔200 μl 接種到96 孔板上，常規培養過夜后棄培養液，加入含不同濃度蘿卜硫素〔終濃度分別為0（對照）、1、2、5、10、20、40 μmol/L〕的RPMI1640 培養液，每個濃度設置6 個復孔。繼續培養48 h 后每孔添加25 μl MTT 溶液（5 mg/ml），再繼續培養4 h 后棄上清液，每孔加入150 μl 二甲基亞砜（DMSO）溶液，于搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解，最后用酶標儀（波長490 nm）測定各孔吸光度（OD 值），計算SW480 細胞增殖抑制率，并繪制細胞生長曲線。細胞增殖抑制率（%）=（OD 值對照組-OD 值實驗組）/OD 值對照組×100%。

1.2.3 細胞分組及處理 將SW480 細胞分為對照組、低、中、高濃度組，其中對照組不進行藥物處理，低、中、高濃度組分別采用1、2、5 μmol/L 蘿卜硫素處理。

1.2.4 平板克隆實驗測定SW480 細胞集落形成能力 取對數期SW480 細胞，胰蛋白酶消化制備單細胞懸液，接種于6 孔板中，按照1.2.3 分組處理細胞，靜置培養2 w 后，當培養皿中出現肉眼可見的克隆時，終止培養，棄去上清液，甲醇固定、結晶紫染色，洗去染色液，洗滌后在顯微鏡下計數細胞個數≥50 的單克隆集落，計算集落形成率（表示SW480 細胞集落形成能力）。集落形成率（%）=集落數/接種數×100%。

1.2.5 Transwell 侵襲實驗測定SW480 細胞侵襲能力 將200 μg/ml 基質膠以200 μl/cm2鋪在Transwell 小室上室，待其凝固，備用。用RPMI1640 培養液（不含FBS）將SW480 細胞調整為1×105個/ml的細胞懸液，取200 μl 細胞懸液接種到Transwell 上室，600 μl 含10% FBS 的RPMI1640 培養液加入下室，待SW480 細胞貼壁后棄上清液，按照1.2.3 分組處理細胞（RPMI1640 培養液不含FBS），每組設置6 個復孔。繼續培養48 h 后取出Transwell 小室，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3 次后用棉球輕擦上室濾膜表面殘存細胞，在4℃下10%甲醛固定10 min，PBS 洗滌后室溫下0.1%結晶紫染色30 min，PBS 再次洗滌。倒置顯微鏡下觀察染色細胞，隨機選擇6個視野計數（即侵襲細胞數，表示SW480 細胞侵襲能力），結果取平均值。

1.2.6 劃痕實驗測定SW480 細胞遷移能力 將SW480 細胞接種于6 孔板，當其單層平鋪底部時，用滅菌后的200 μl 槍頭垂直于底部，均勻劃出一道劃痕，隨后用PBS 洗滌3 次，用倒置顯微鏡觀察劃痕并拍照（記錄為0 h 劃痕距離），接著按照1.2.3分組處理細胞（RPMI1640 培養液不含FBS），每組設置6 個復孔。繼續培養48 h 后用倒置顯微鏡觀察細胞劃痕情況并拍照（記錄為48 h 劃痕距離），計算劃痕愈合率（表示SW480 細胞遷移能力）。劃痕愈合率（%）=（0 h 劃痕距離-48 h 劃痕距離）/0 h劃痕距離×100%。

1.2.7 Western 印跡法測定SW480 細胞中Notch 通路相關蛋白、增殖相關蛋白及遷移侵襲相關蛋白表達水平 將SW480 細胞接種于6 孔板，按照1.2.3分組處理細胞48 h 后收集細胞，用細胞裂解液充分裂解后離心，以提取各組SW480 細胞總蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度。各組取50 μg 蛋白上樣，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離后轉至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，5% BSA 室溫封閉1 h 后加入兔抗人Notch1、Notch3、Hes1、Ki-67、PCNA、MMP-9、E-cadherin 及內參β-actin 抗體（稀釋比例均為1 ∶1 000）作為一抗，4℃孵育過夜，PBS 洗滌3 次后加入HRP 標記的山羊抗兔IgG（稀釋比例1 ∶1 000）作為二抗，室溫孵育30 min，PBS 洗滌后ECL 顯色，Tanon 凝膠分析系統掃描圖像，分析各條帶灰度。

1.3 統計學分析 采用SPSS25.0 軟件進行t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結果

2.1 蘿卜硫素對SW480 細胞作用濃度的篩選結果 與0 μmol/L 蘿卜硫素處理SW480 細胞后，細胞增殖抑制率〔（2.01±0.91）%〕相比，1、2、5、10、20、40 μmol/L 蘿卜硫素處理SW480 細胞后，細胞增殖抑制 率〔（7.29 ± 2.06）%，（13.09 ± 4.28）%，（27.18±4.54）%，（37.98 ± 5.91）%，（55.84 ±7.53）%，（79.85±8.54）%〕均顯著升高，并呈濃度依賴性（均P＜0.05）。當蘿卜硫素濃度≤5 μmol/L時，作用48 h后SW480 細胞增殖抑制率均＜30%，即此時細胞相對活力＞70%，故選取蘿卜硫素濃度為1、2、5 μmol/L進行后續實驗，以防止細胞活力過低影響Transwell 侵襲實驗和劃痕實驗結果。

2.2 蘿卜硫素對SW480 細胞集落形成能力的影響 與對照組SW480 細胞集落形成率〔（77.16 ±6.14）%〕相比，低、中、高濃度組〔（63.04 ±4.98）%，（51.18±6.79）%，（39.44±6.08）%〕顯著降低；且呈濃度依賴性（均P＜0.05）。見圖1。

圖1 蘿卜硫素對SW480 細胞集落形成能力的影響(結晶紫染色,×40)

2.3 蘿卜硫素對SW480 細胞侵襲能力的影響 與對照組SW480 細胞侵襲細胞數〔（85.26±9.19）個〕相比，低、中、高濃度組〔（69.09±8.95）個，（53.68±7.78）個，（39.94±6.26）個〕顯著減少且呈濃度依賴性（P＜0.05）。見圖2。

圖2 蘿卜硫素對SW480 細胞侵襲能力的影響(結晶紫染色,×200)

2.4 蘿卜硫素對SW480 細胞遷移能力的影響 與對照組 SW480 細 胞劃痕愈 合率〔（94.47 ±10.56）%〕 相 比，低、中、高濃度 組〔（76.48 ±9.17）%，（61.17±9.69）%，（42.85±7.46）%〕顯著降低，且呈濃度依賴性（均P＜0.05）。見圖3。

圖3 蘿卜硫素對SW480 細胞遷移能力的影響(×100)

2.5 蘿卜硫素對SW480 細胞中Notch 通路的影響 與對照組相比，低、中、高濃度組SW480 細胞中Notch 通路相關蛋白Notch1、Notch3、Hes1 相對表達量均顯著降低，且呈濃度依賴性（均P＜0.05）。見表1，圖4。

表1 蘿卜硫素對SW480 細胞中Notch 通路、Ki-67、PCNA、MMP-9、E-cadherin 蛋白表達的影響(,n=6)

表1 蘿卜硫素對SW480 細胞中Notch 通路、Ki-67、PCNA、MMP-9、E-cadherin 蛋白表達的影響(,n=6)

與對照組比較:1）P＜0.05；與低濃度組比較:2）P＜0.05；與中濃度組比較:3）P＜0.05

圖4 蘿卜硫素對SW480 細胞中Notch 通路的影響

2.6 蘿卜硫素對SW480 細胞中增殖及遷移侵襲相關蛋白表達的影響 與對照組相比，低、中、高濃度組SW480 細胞中Ki-67、PCNA、MMP-9 蛋白相對表達量顯著降低，E-cadherin 蛋白相對表達量顯著升高，且均呈濃度依賴性（均P＜0.05）。見表1，圖5。

圖5 蘿卜硫素對SW480 細胞中Ki-67、PCNA、MMP-9、E-cadherin 蛋白表達的影響

3 討論

結腸癌的發病率和死亡率仍呈逐年上升趨勢，手術切除、放療、化療、生物治療或分子靶向治療是其常用臨床治療方式，隨著科學技術的進步、綜合治療的發展，結腸癌患者的預后雖有一定程度改善，但腫瘤浸潤深或有淋巴結轉移的結腸癌患者生存率仍較低，且放療、化療副作用大，嚴重影響患者的生活質量〔9，10〕。

研究發現，蘿卜硫素能夠抑制人結腸癌HT-9細胞、SW620 細胞增殖，并誘導其凋亡，且抑制SW620 細胞侵襲及轉移的機制可能與其降低MMP-2、MMP-9 蛋白表達有關〔11，12〕。顧文燕等〔13〕發現，蘿卜硫素可通過上調Bax 表達促使結腸癌SW480細胞凋亡，并增強5-氟尿嘧啶對癌細胞化療耐受的能力。本研究結果提示在1～40 μmol/L 濃度范圍內，蘿卜硫素能顯著抑制SW480 細胞增殖，能呈濃度依賴性降低SW480 細胞集落形成、侵襲、遷移能力。Ki-67、PCNA 均與細胞增殖活性相關，研究發現，下調結腸癌HT-29 細胞裸鼠皮下移植瘤組織細胞中PCNA、Ki-67 的表達，可抑制移植瘤細胞增殖〔14〕；MMP 能夠降解細胞外基質和基底膜促進腫瘤細胞侵襲和遷移，研究發現，下調MMP-9 表達能夠顯著抑制結腸癌LoVo 細胞的遷移和侵襲能力〔15〕；E-cadherin 作為一種鈣依賴性黏附分子，其表達缺失可降低細胞黏附能力、增強其分散能力，研究發現，結腸癌HCT116 細胞的轉移受抑制可能與上調E-cadherin 表達相關〔16〕。本研究結果提示蘿卜硫素能夠通過下調Ki-67、PCNA、MMP-9 蛋白表達，上調E-cadherin 蛋白表達，進而抑制SW480 細胞增殖、侵襲和遷移，與既往研究結果類似〔14～16〕。

Notch 信號通路作為高度保守的信號轉導途徑，其異常激活與腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移密切相關，目前發現該通路存在Notch1、Notch2、Notch3、Notch4 4 個受體，Hes1 為其常見的經典下游基因。研究表明，抑制過度激活的Notch1/Hes1 信號通路可抑制HT29 和HCT116 細胞等結腸癌細胞生長〔17〕。高蕊等〔7〕在SW480 細胞中發現，蘆丁可以通過抑制Notch1 與Hes1 介導的細胞增殖分化途徑實現對結腸癌的治療作用。Wang 等〔18〕發現MicroRNA-206 可通過靶向下調Notch3 表達，進而抑制結直腸癌SW480 和SW620 細胞增殖和遷移。本研究結果提示蘿卜硫素能明顯抑制Notch 信號通路相關受體Notch1、Notch3 及下游基因Hes-1 蛋白表達，抑制Notch 信號通路激活。