IL-2 聯合IL-27 對NK 細胞殺傷結直腸癌細胞的作用及機制

吳紅芳 張冬云 張海燕 吳勤祥 魏嚴 王靜 張云霞

（南陽醫學高等專科學校 1 基礎醫學部,河南 南陽 473000;2 第一附屬醫院病理科;3 第一附屬醫院普外科）

免疫細胞與腫瘤的生長、侵襲、轉移具有緊密的相關性，其中自然殺傷（NK）細胞在免疫監視中起重要作用，且其通常被公認為抗腫瘤免疫的有益細胞群〔1〕。NK 細胞的消耗可導致循環腫瘤細胞存活數量的增加，誘導癌癥的進一步惡化〔2～5〕。據報道，免疫細胞在結直腸癌、胃癌、食管癌中均具有調控作用〔6〕。白細胞介素（IL）-2 和IL-27 是普通γ 鏈細胞因子家族的一員，由于其復雜的結構和功能，已引起研究者的廣泛關注。輔助性T 細胞（TH）、濾泡性輔助性T 細胞（TFH）、Th2 和自然殺傷性T 細胞（NKT）均可產生IL-2、IL-27〔7，8〕。本研究將通過觀察IL-2 與IL-27 對NK 細胞的分化及抗結直腸癌能力的影響，揭示其影響NK 細胞殺傷結腸癌細胞功能的作用及機制，為結直腸癌的細胞免疫治療的探索提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 人結直腸癌細胞HCT116 購自ATCC；外周血細胞來自南陽醫學高等專科學校第一附屬醫院確診并經放化療治療的結直腸癌患者10 例，患者及家屬均簽署知情同意書。DMEM 培養基、胎牛血清、CCK-8 試劑、胰蛋白酶均購自美國Sellect 公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒購自大連Takara公司；聚偏氟乙烯（PVDF）膜購自德國羅氏公司；十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）試劑盒、電化學發光（ECL）液和RIPA 蛋白裂解液均購自碧云天生物技術公司；鼠抗人單克隆抗體腫瘤壞死因子（TNF）-α 和TNF-β、山羊抗鼠免疫球蛋白（Ig）G、異硫氰酸熒光素（FITC）標記的鼠抗人CD3 單克隆抗體，腫瘤組織腺瘤樣息肉蛋白（APC）標記鼠抗人CD16 單克隆抗體，PE 標記的鼠抗人CD56 單克隆抗體及同型對照單克隆抗體（FITC IgG2b，APC IgG2a，PE IgG2a）均購自美國EB 公司。

1.2 細胞培養 將結直腸癌細胞HCT116 用含10%胎牛血清的DMEM 培養基，置于37℃，5% CO2的恒溫培養箱中常規培養，待細胞生長至融合度75%左右，用胰蛋白酶消化約1 min，按照1 ∶3的比例更換培養基，每2 d 傳代一次。

1.3 流式細胞術檢測及分選CD3-、CD16+、CD56+NK 細胞、NK 細胞 按照Ficoll 的力度梯度離心法分離外周血單個核細胞（PBMC），將其標記為Before culture 組。將PBMC 置于細胞培養箱中常規培養，2～3 d 更換一次培養基，連續培養14 d，標記為After culture 組，空白對照標記為Untreated 組，用磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸細胞，依次加入抗體（D3-FITC，CD16-APC，CD56-PE），最后通過流式細胞儀檢測、分選CD3-、CD16+、CD56+NK 細胞、NK 細胞。將IL-2、IL-27、IL-2 聯合IL-27 培養的PBMC 標記為IL-2組、IL-27 組、IL-2+IL-27 組。將其進行常規培養14 d，按照上述方法用流式細胞術進行檢測、分選CD3-、CD16+、CD56+NK 細胞、NK 細胞。

1.4 CCK-8 法檢測NK 細胞對結直腸癌細胞的殺傷作用 調整結直腸癌細胞HCT116 至105個/ml。將IL-2 組、IL-27 組、IL-2+IL-27 組分化的CD3-、CD16+、CD56+NK 細胞、NK 細胞作為效應細胞，再加入靶細胞孵育24 h。按照效應細胞∶靶細胞（E ∶T）20 ∶1、10 ∶1、5 ∶1的比例加入效應細胞，培養4 h，再加入CCK-8（20 μl），在450 nm 波長下檢測細胞的吸光值（OD）。NK 細胞對結直腸癌細胞HCT116的殺傷率=〔1-（OD 效應細胞/OD 對照細胞）〕×100%。

1.5 Western 印跡檢測NK 細胞中TNF-α、TNF-β的蛋白表達 RIPA 蛋白裂解液對對數期細胞進行冰上蛋白裂解1 h，提取總蛋白，以BCA 法測定樣品蛋白的濃度。以4 ∶1的比例加入蛋白上樣緩沖液，混勻，沸水浴變性5 min，離心取上清，取60 μg 目的蛋白、蛋白Marker 進行SDS-PAGE。然后將蛋白濕轉至PVDF 膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST 洗滌，4℃條件下，將封閉后的PVDF 膜放入1 ∶1 000倍稀釋的一抗（鼠抗人單克隆抗體TNF-α、TNF-β）中反應過夜，以封閉液洗膜3 次，每次5 min，再在37℃下將PVDF 膜轉入1 ∶2 000 倍稀釋的二抗（山羊抗鼠IgG）中反應2 h。于暗室內ECL 試劑盒顯影曝光:滴加化學發光劑顯影，以凝膠成像系統采集圖像。Qμantity One 4.62 圖像分析軟件進行條帶灰度分析，Image J 分析目的條帶的灰度值，以β-actin 為內參，以目的條帶灰度值與β-actin 灰度值的比值表示目的蛋白的表達情況。

1.6 統計學處理 采用SPSS21.0 軟件進行分析。所有試驗進行3 個平行實驗，實驗重復3 次。計量資料用均數±標準差（）表示，多組間數據比較采用單因素方差分析，兩組比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 培養前后對NK 細胞水平的影響 與Before culture 組相比，After culture 組細胞中CD3-、CD16+、CD56+NK、NK 細胞的分化率均顯著升高（P＜0.05）。見表1。

表1 流式檢測NK 細胞CD3-、CD16+、CD56+、NK細胞的比例(,n=9,%)

表1 流式檢測NK 細胞CD3-、CD16+、CD56+、NK細胞的比例(,n=9,%)

2.2 IL-2 聯合IL-27 對NK 細胞增殖無影響 Untreated 組、IL-2 組、IL-27 組、IL-2+IL-27 組PMBC 中CD3-CD56+NK 細胞的表達率均無顯著性差異。見表2。

表2 IL-2 聯合IL-27 對CD3-CD56+NK細胞陽性率及NKG2D 受體表達的影響(,n=9)

表2 IL-2 聯合IL-27 對CD3-CD56+NK細胞陽性率及NKG2D 受體表達的影響(,n=9)

與Untreated 組比較:1）P＜0.05；與IL-2 組比較:2）P＜0.05；與IL-27 組相比較:3）P＜0.05

2.3 IL-2 聯合IL-27 誘導促進NK 細胞表面NKG2D 受體的表達 與Untreated 組相比，IL-2 組、IL-27 組PMBC 中NKG2D 表達率均顯著升高；與IL-2 組或IL-27 組相比，IL-2+IL-27 組PMBC 中NKG2D表達率均顯著升高（P＜0.05）。見表2。

2.4 IL-2 聯合IL-27 誘導增強NK 細胞對結腸癌細胞的殺傷作用 與Untreated 組相比，IL-2 組、IL-27組PMBC 中E ∶T=10 ∶1、E ∶T=20 ∶1所占比率均顯著升高；與IL-2 組或IL-27 組相比，IL-2+IL-27 組PMBC 中E ∶T=10 ∶1、E ∶T=20 ∶1所占比率均顯著升高（P＜0.05）。見表3。

表3 NK 細胞對結腸癌細胞的殺傷作用(,n=9,%)

表3 NK 細胞對結腸癌細胞的殺傷作用(,n=9,%)

2.5 IL-2 聯合IL-27 誘導增強NK 細胞中TNF-α和TNF-β 的表達 與Untreated 組相比，IL-2 組、IL-27 組TNF-α 和TNF-β 表達均顯著升高；與IL-2 組或IL-27 組相比，IL-2+IL-27 組TNF-α 和TNF-β 表達均顯著升高（P＜0.05）。見表4、圖1。

圖1 Western 印跡檢測NK 細胞中TNF-α 和TNF-β 的表達

表4 IL-2 聯合IL-27 誘導增強NK 細胞TNF-α 和TNF-β 的分泌(,n=9)

3 討論

NK 細胞在針對腫瘤和病毒感染細胞的先天免疫中起主要作用。據報道〔9，10〕，IL-2 刺激對小鼠中NK 細胞抑制性受體Ly49A 的表達明顯增加，但對NK 細胞激活性受體Ly49C 和Ly49D 的表達沒有變化，且IL-2 刺激增加了NK 細胞群和活化標記NK1.1 的表達，并不引起NK 細胞的過度增殖、巨噬細胞炎癥蛋白（MIP）-1α 和γ 干擾素（IFN-γ）的增加，暗示了一種與IL-2 組合療法結合的免疫療法的新思路。Dondero 等〔11〕發現，IL-27 未表現出促血管生成的特性，卻具有上調程序性死亡受體-配體（PDL）2 和淋巴細胞抗原（HLA）-1 在腫瘤內皮表達的能力。IL-2 和IL-27 對NK 細胞及腫瘤的影響未曾有明確的益處，但是IL-2 聯合IL-27 對腫瘤患者是否具有積極的影響目前尚且未知。武海英等〔12〕在研究中發現，IL-21 聯合IL-21 可上調NK 細胞的增殖能力和NKG2D 的表達，增強患者的自然免疫屏障功能。因此，推測IL-2 聯合IL-27 可能對NK 殺傷結直腸癌細胞具有益處。本研究發現，IL-2 聯合IL-27 可增強結直腸癌患者外周血中CD3-、CD16+、CD56+、NK 的細胞的分化率，上調NK 細胞表面NKG2D 受體的表達，這與前人〔12〕關于IL-2、IL-27對NK 細胞的作用均相吻合，這也說明了IL-21 聯合IL-21 可促進NK 細胞的分化及NKG2D 受體表達的功能，為探索IL-2 聯合IL-27 在結直腸癌中的潛在治療價值提供參考依據；有趣的是，IL-2 聯合IL-27對NK 細胞的增殖無明顯的影響，但其機制仍未清楚。

近些年，腫瘤的免疫治療成為繼常規的手術、放化療之后的新興的治療方法，其具有自身獨特的優勢。免疫治療是基于機體最基礎的先天免疫展開的一種增強免疫力的抗癌方法〔13，14〕。NK 細胞為機體先天免疫的淋巴細胞，參與抗腫瘤、抗感染等保護功能〔15〕。據報道，NK 細胞參與抑制腫瘤的發生發展過程，同 時也發 生機體 的免疫逃 避〔16，17〕。Coca等〔18〕、Ishigami 等〔19〕在結直腸癌、胃癌的研究中報道，NK 細胞有益于患者病情的轉歸。Shimaoka等〔20〕在研究中發現，抗小鼠IL-6 受體抗體（MR16-1）相較于細胞因子的免疫抑制劑托法替尼對結腸癌小鼠具有明顯的增強NK 細胞的增殖和分化及抑制結腸癌小鼠發生肺轉移的優勢，提示NK 細胞在抗腫瘤中的重要作用。本研究發現，IL-2 聯合IL-27可增強NK 細胞對結腸癌細胞的殺傷作用，揭示了IL-2 和IL-27 聯合通過增強NK 細胞殺傷力對結直腸癌發揮抑制作用，為開發結直腸癌的新藥提供新思路；深入研究，IL-2 聯合IL-27 可增強NK 細胞對結腸癌的殺傷能力，其機制與上調TNF 表達密切相關。