姜黃素對血管性癡呆大鼠認知和記憶功能障礙及海馬神經再生的影響

李相華 譚雙 劉春芹 李永秋 （唐山市工人醫院神經內科,河北 唐山 063000）

血管性癡呆（VD）是一種由腦血管病變引起的腦組織損傷，從而導致認知功能障礙的疾病，主要表現為記憶、認知、思維等功能減退〔1〕。我國60 歲以上的人群VD 發病率為1.3%～2.4%，是僅次于阿爾茨海默病的第二大癡呆類疾病〔2〕。姜黃素是姜黃根莖的主要成分，有抗菌、抗炎、抗氧化等作用，對阿爾茨海默病等神經退行性疾病有保護神經的作用〔3〕。本研究分析姜黃素對VD 大鼠認知和記憶功能障礙及海馬神經再生的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與藥品 雄性健康SD 大鼠30 只，8 周齡，體重220～250 g，許可證號:SYXK（冀）2019-011，購自華北制藥股份有限公司。姜黃素購自廣州龍德生物科技有限公司，純度 99%，批號:19050302，生產批號:SC20141011000026。

1.1.2 試劑與儀器 Morris 水迷宮購自中國醫學科學院藥物所；蛋白提取試劑盒購自北京普利萊公司；腦源性神經生長因子（BDNF）抗體、酪氨酸蛋白激酶受體（Trk）B 抗體均購自北京義翹神州科技股份有限公司；JC-1 線粒體膜電位檢測試劑盒購自上海翌圣生物科技有限公司；CytoFLEX 流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司；Cleaved Caspase-3、Ki-67抗體購自美國Abcam。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型建立及實驗分組 按照參考文獻〔4〕方法，將大鼠隨機分為假手術組、模型組和實驗組各10 只。4%水合氯醛1 ml/10 g 腹腔注射麻醉大鼠，完全暴露大鼠頸部皮膚，沿皮膚中線切開約1.5 cm切口，將右側頸總動脈與迷走神經分開后進行分段結扎，結扎后剪斷頸總動脈，尾頸總動脈不做處理。假手術組不做結扎與切斷頸總動脈。

1.2.2 評定造模成功的標準 按照參考文獻〔5〕方法，造模約1 w 后，待大鼠頸部傷口愈合，對大鼠進行Morris 水迷宮行為學測評，以假手術組逃避潛伏期為參考值，計算各組逃避潛伏期與參考值之差，若比值＞20%，則評定為有認知功能障礙的大鼠，即造模成功。

1.2.3 給藥方法 造模評定成功后開始給藥，實驗組給予姜黃素300 mg/kg 灌胃，1 次/d，持續4 w。假手術組和模型組給予等量生理鹽水灌胃。

1.2.4 Morris 水迷宮實驗 按照參考文獻〔6〕方法，各組大鼠在造模成功28 d 后進行Morris 水迷宮，連續5 d，2 次/d。大鼠頭朝向池壁從4 個不同的象限中點放入水中，讓大鼠在水中自由游動，如果大鼠能在2 min 內爬上平臺，則讓大鼠在平臺上停留30 s，幫助大鼠強化記憶；如果大鼠不能尋找到平臺，則由實驗者引導大鼠至平臺，然后讓大鼠在平臺上停留30 s。大鼠實際尋找平臺的時間為逃避潛伏期。在水池正上方設有攝像系統記錄大鼠從不同入水點爬上站臺消耗的時間為逃避潛伏期，取當日訓練逃避潛伏期的平均值為當日逃避潛伏期。空間探索試驗:訓練5 d 結束后拆去平臺，將大鼠從原平臺所在象限的對側象限中點頭朝向池壁放入水中，記錄大鼠2 min 內穿越原有平臺位置的次數和游動的速度。

1.2.5 Western 印跡檢測蛋白的表達 按照參考文獻〔7〕方法，取大鼠右側海馬組織加入裂解液，充分裂解后離心30 min，取上清液。1 ∶4加入蛋白緩沖液，煮沸變性10 min。經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后，轉膜，漂洗5 min，5%脫脂奶粉室溫封閉60 min，分別加入相應的一抗4℃孵育過夜。次日采用Tris 鹽酸緩沖鹽溶液加吐溫（TBST）漂洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，37℃孵育1 h，電化學發光（ECL）顯影，保存圖像。運用Image J 軟件分析X 光片中條帶的灰度值，BDNF、Cleaved Caspase-3、Ki-67、TrkB 表達水平用灰度值表示，內參為β-actin。每個實驗重復3 次。

1.2.6 流式細胞術檢測海馬神經細胞凋亡率 按照參考文獻〔8〕方法，將大鼠斷頭后用75%乙醇消毒5 min，在冰盤上快速分離取出海馬，剪碎海馬組織輕輕研磨，經300 目篩網過濾，配制細胞懸液，以4 000 r/min離心3 min，去掉上清液，加入JC-1 工作液，37℃避光孵育20 min，用流式細胞儀檢測。

1.2.7 細胞計數檢測（CCK）-8 實驗檢測細胞增殖 按照1.2.6 中方法收集細胞，接種到96 孔板內，培養24 h 后，在每個孔內添加CCK-8 溶液10 μl，放在37℃孵育4 h。用酶標儀檢測450 nm 的OD 值。細胞存活率=實驗組OD 值/對照組OD 值×100%。

1.3 統計學分析 采用SPSS25.0 軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結果

2.1 行為學變化 與假手術組相比，模型組逃避潛伏期顯著延長，穿越平臺的次數和游動速度明顯降低（均P＜0.05）；與模型組相比，實驗組逃避潛伏期顯著縮短，穿越平臺的次數和游動速度顯著增加（均P＜0.05）。見表1。

表1 各組逃避潛伏期及穿越原有平臺位置的次數和游動速度(,n=10)

表1 各組逃避潛伏期及穿越原有平臺位置的次數和游動速度(,n=10)

與假手術組比較:1）P＜0.05；與模型組比較:2）P＜0.05；表2 同

2.2 海馬中BDNF、TrkB 蛋白表達 與假手術組相比，模型組BDNF 和TrkB 蛋白的表達顯著減少（P＜0.05）；與模型組相比，實驗組BDNF、TrkB 蛋白表達顯著增加（P＜0.05）。見表2 和圖1。

圖1 各組BDNF、TrkB 蛋白表達條帶

表2 3 組海馬BDNF、TrkB 蛋白表達、神經細胞凋亡、存活及Ki-67、Cleaved Caspase-3 表達(,n=10)

表2 3 組海馬BDNF、TrkB 蛋白表達、神經細胞凋亡、存活及Ki-67、Cleaved Caspase-3 表達(,n=10)

2.3 海馬神經細胞凋亡率 與假手術組相比，模型組海馬神經細胞凋亡率和凋亡蛋白 Cleaved Caspase-3 表達量顯著升高，細胞存活率和增殖蛋白Ki-67 表達量顯著降低（均P＜0.05）；與模型組相比，實驗組海馬神經細胞凋亡率和凋亡蛋白Cleaved Caspase-3 表達量顯著降低，細胞存活率和增殖蛋白Ki-67 表達量顯著升高（均P＜0.05）。說明姜黃素可減少海馬神經細胞的凋亡。見表2。

3 討論

VD 占所有癡呆病例的15%～20%，有研究表明〔9〕，海馬的膽堿能神經元對學習和記憶功能有重要影響。BDNF 主要分布在大腦皮質、脊髓及海馬，BDNF 不僅與神經元的生長及存活有關，而且可調節突觸傳傳遞和可塑性，與學習記憶功能有密切關聯。BDNF 表達增加是神經元反應性的自我保護，通過與受體TrkB 或p75NTR 結合，能維持神經元存活、減輕神經元損傷〔10〕。BDNF 對于運動神經、中樞及外周神經而言是一個有效的生長因子，BDNF對神經元的存活有關鍵作用，其可作為信號通路的配體與TrkB 結合，以激活細胞內信號傳導通路來促進神經元細胞發育、分化和再生〔11〕。研究表明〔12〕，BDNF 與海馬神經發生和海馬細胞增殖有關，海馬長時程增強作用是由BDNF/TrkB 信號傳遞誘導的。有研究報道〔13〕，姜黃素能在缺血性腦卒中發揮作用。本實驗結果提示BDNF 基因可促進海馬細胞增殖，并延長細胞存活時間，這可能是姜黃素促進細胞再生的原因。

綜上，姜黃素能改善VD 大鼠認知和記憶功能障礙，通過提高BDNF 和TrkB 蛋白的表達，促進海馬神經細胞再生，具有防治VD 的作用。