過表達miR-4731-5p通過調節PRR11表達對結直腸癌HT-29細胞增殖和凋亡的影響

湯守元 蘭國玉 黃耿 朱鐘鐘 羅海平 姜進平

1鄂東醫療集團黃石市中心醫院（湖北理工學院附屬醫院）胃腸肛腸外科 435000；2鄂東醫療集團黃石市中心醫院（湖北理工學院附屬醫院）泌尿外科 435000

結直腸癌是最常見的消化系統惡性腫瘤之一，也是腫瘤相關死亡的主要原因，結直腸癌發病年齡呈現年輕化的趨勢，且其發病率在不斷上升［1］。惡性增殖和凋亡減少是結直腸癌細胞的重要生物學特征，結直腸癌細胞增殖和凋亡水平的改變與眾多分子信號通路的激活或失活有關［2］。因此，結直腸癌發病機制的研究有助于結直腸癌新型治療靶點的發現。微小RNA（miRNA，miR）的表達與結直腸癌細胞的增殖活力和凋亡水平有關，體外研究和體內研究均表明miRNA 參與調控結直腸癌的發生發展，與結直腸癌的臨床分期、惡性程度、化療耐藥等相關［3-4］。研究顯示，黑色素瘤患者血清中存在miR-4731，相對于Ⅲ期黑色素瘤患者，miR-4731 在Ⅳ期患者的轉移性黑色素瘤組織中表達較少，miR-4731 過表達能夠抑制黑色素瘤細胞的集落形成，miR-4731 表現為抑癌基因作用［5］。miR-4731-5p 對結直腸癌發生發展的影響及其作用機制尚不明確。本研究旨在觀察miR-4731-5p對結直腸癌細胞增殖活力和凋亡水平的作用，探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株與主要試劑 結直腸癌HT-29 細胞購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫；陰性序列miR-NC、miR-4731-5p 類似物購于上海碧云天生物技術有限公司；DMEM 培養基購于美國Gibco 公司；胎牛血清購于杭州四季青生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒購于上海生工生物工程股份有限公司；Lipofectamine 3000 轉染試劑和實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）試劑盒購于購自美國Invitrogen 公司；超敏ECL發光試劑盒購于美國Thermo 公司；蛋白濃度測定試劑盒購于上海碧云天生物科技有限公司；一抗CDK3、GAPDH、c-IAP1、富含脯氨酸蛋白11（proline-rich protein 11，PRR11）和辣根過氧化物酶標記的二抗購于美國BD公司。

1.2 細胞培養和轉染 取出液氮罐凍存的結直腸癌HT-29細胞，快速復蘇后接種于含10%胎牛血清DMEM培養基中，于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養。取對數生長期的HT-29 細胞接種于24 孔板，按照Lipofectamine 3000 試劑說明書，分別轉染miR-4731-5p 類似物（miR-4731-5p組）和陰性對照miR-NC（miR-NC 組）。轉染8 h 后更換完全培養基，培養24 h分析轉染效率。

1.3 生物信息學預測miR-4731-5p 的靶基因 采用生物信息學軟件miRTarBase 分析miR-4731-5p 的靶基因，PRR11 基因信使RNA（mRNA）存在miR-4731-5p 的結合位點，提示PRR11可能是miR-4731-5p的靶基因。

1.4 qRT-PCR 檢 測miR-4731-5p 和PRR11 mRNA 的相對表達量 提取轉染24 h 的HT-29 細胞總RNA，分別檢測RNA 純度和濃度，反轉錄合成cDNA。配制qRT-PCR 反應液，miR-4731-5p 的相對表達量以U6 為內參，PRR11 mRNA 的相對表達量以GAPDH 為內參。引物序列如下：miR-4731-5p正向引物5’-CACACTCATGTGGCCCCCAGC-3’，反向引物5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’ ；U6 正向引物5’-TGACACGCAAATTCGTGAAGCGTTC-3’，反向引物5’-CCAGTCTCAGGGTCCGAGGTATTC-3’；GAPDH 正向引物 5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，反向引物5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’；PRR11 正向引物5’-GAAGCTGGCTAACATCATCCTG-3’，反向引物5’-CTCTGGGTTATGCAGTTCTGG-3’。根據2-ΔΔCt方法計算miR-4731-5p和PRR11 mRNA的相對表達量。

1.5 Western blot 檢測HT-29 細胞中PRR11 蛋白表達量 收集轉染48 h 的HT-29 細胞，配制蛋白裂解液并提取總蛋白，測定蛋白濃度。配制十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，每組取20 μg 蛋白樣品電泳，將蛋白轉至硝酸纖維素膜，7%脫脂牛奶在搖床上封閉4 h。依照稀釋比為1∶1 000配制一抗，4 ℃孵育過夜。依照稀釋比為1∶5 000配制二抗，室溫搖床孵育4 h。配制發光液，在每條條帶上滴加發光液，在熒光成像儀中曝光和拍照。

1.6 集落形成實驗檢測miR-4731-5p 對HT-29 細胞增殖的影響 收集轉染48 h 的HT-29 細胞，以2×103個/孔接種于6 孔板，每組3 個復孔，于培養箱連續培養14 d。將集落與3%的多聚甲醛進行混合，采用質量分數0.3%的結晶紫溶液染色40 min。流水清洗，在室溫下晾干，計數集落形成數，計算平均值。

1.7 流式細胞術檢測miR-4731-5p對HT-29細胞凋亡的影響 收集轉染48 h 的HT-29 細胞，采用PBS 溶液洗滌4 次，離心棄上清，采用600 μl 結合液重懸細胞，加入5 μl Annexin V-FITC 溶液充分混勻，加入5 μl 碘化丙啶溶液充分混勻。避光孵育20 min 后，采用流式細胞儀分析每組HT-29細胞的凋亡率。

1.9 統計學分析 采用SPSS 21.0軟件進行統計分析，計量資料符合正態分布，均以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較應用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組HT-29 細胞中miR-4731-5p 的相對表達量miR-NC 組和miR-4731-5p 組HT-29 細胞中miR-4731-5p的相對表達量分別為（1.05±0.16）和（7.91±1.26），miR-4731-5p 組miR-4731-5p 的表達是miR-NC 組的7.53倍，差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.2 生物信息學預測miR-4731-5p 的靶基因 采用生物信息學軟件miRTarBase 對miR-4731-5p 的靶基因預測，miR-4731-5p 的靶基因可能是PRR11，miR-4731-5p 可能與PRR11基因mRNA的結合位點見圖1。

圖1 miR-4731-5p與PRR11基因mRNA互補結合位點

2.3 過表達miR-4731-5p對PRR11 mRNA相對表達量的影響 miR-NC 組和miR-4731-5p 組HT-29 細胞中PRR11 mRNA的相對表達量分別為（1.02±0.12）和（0.28±0.11），差異有統計學意義（P＜0.01），提示miR-4731-5p 可有效抑制PRR11 mRNA的表達。

2.4 過表達miR-4731-5p 對PRR11 蛋白表達量的影響 Western blot 結果（圖2）表明，miR-4731-5p 組HT-29 細胞中PRR11 蛋白表達降低，細胞增殖蛋白CDK3表達降低，細胞凋亡抑制蛋白c-IAP1表達降低。

圖2 miR-4731-5p對HT-29細胞PRR11蛋白表達的影響

2.5 過表達miR-4731-5p 對HT-29 細胞增殖水平的影響 如圖3，miR-NC 組和miR-4731-5p 組HT-29 細胞的集落形成數分別為（148.90±20.55）個和（51.25±12.81）個，差異有統計學意義（P＜0.01），提示miR-4731-5p 可抑制結直腸癌HT-29細胞的增殖。

圖3 miR-4731-5p對HT-29細胞增殖能力的影響

2.6 過表達miR-4731-5p 對HT-29 細胞凋亡能力的影響 如圖4，miR-NC 組和miR-4731-5p 組HT-29 細胞凋亡率分別為（5.79±0.72）%和（22.19±2.62）%。與miR-NC 組相比，miR-4731-5p 組HT-29 細胞凋亡率明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.01），提示miR-4731-5p 可促進結直腸癌HT-29細胞凋亡。

圖4 miR-4731-5p對HT-29細胞凋亡水平的影響

3 討 論

最近的系列研究表明，miRNA 在結直腸癌中表達上調或下調，顯著影響結直腸癌細胞的代謝、分化、生長及凋亡等過程，表現為明顯的抑癌基因或致癌基因作用［6-7］。Zhang等［8］研究發現，miR-802在結直腸癌組織和細胞系中顯著下調，miR-802表達水平低的結直腸癌患者淋巴轉移和遠處轉移率顯著升高，且總生存率更差，轉染miR-802模擬物顯著減弱結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。Liu 等［9］研究發現，有轉移的結直腸癌患者血清外泌體miR-106b-3p的表達水平顯著高于無轉移患者，血清外泌體miR-106b-3p 高表達與不良預后相關，外泌體miR-106b-3p 在體內促進結直腸癌細胞的肺轉移。其中，miR-4731-5p 在神經膠質瘤、黑色素瘤等腫瘤組織中低表達，能夠抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲［5，10］。miR-4731-5p 對結直腸癌增殖和凋亡水平的調控尚不清楚。

本研究結果顯示，過表達miR-4731-5p 后，HT-29 細胞增殖活力降低，細胞凋亡率增加，表明miR-4731-5p在結直腸癌細胞中表現為抑癌基因作用。已有研究證實，miRNA以不完全互補的方式配對結合靶基因mRNA，誘導沉默復合體的形成，降低靶基因的表達［11］。本研究采用生物信息學軟件miRTarBase 預測顯示，miR-4731-5p 可能與PRR11基因mRNA 配對結合。PRR11基因定位于人類染色體17q22，由360 個氨基酸組成［12］。PRR11 蛋白在胰腺癌、非小細胞肺癌、乳腺癌、胃癌等多種腫瘤組織中高表達，與組織分化程度、TNM分期、淋巴結轉移、腫瘤大小相關，沉默PRR11 可抑制腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲，促進細胞凋亡的發生［13-15］。本研究結果顯示，過表達miR-4731-5p 后，HT-29 細胞中PRR11 基因的相對表達量較miR-NC 組降低，表明miR-4731-5p 參與結直腸癌的機制可能是通過抑制PRR11 基因表達實現的。本研究Western blot 結果顯示，miR-4731-5p 抑制PRR11 基因表達后，HT-29 細胞中增殖蛋白CDK3表達降低，凋亡抑制蛋白c-IAP1表達降低，提示HT-29細胞的增殖水平降低，細胞凋亡增加。

總之，過表達miR-4731-5p 可抑制結直腸癌HT-29 細胞的增殖活力，誘導HT-29細胞凋亡增加，其機制可能是通過抑制PRR11基因表達實現的。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突。