黃曲霉素產毒真菌多重聚合酶鏈式反應體系的建立*

葉壵敏，林 娜，張曉芹△，石森林

（1.浙江中醫藥大學，浙江 杭州 310000；2.浙江中醫藥大學附屬麗水市中醫院，浙江 麗水 323000）

真菌毒素污染是影響食品安全的重要因素［1］，其中黃曲霉、寄生曲霉等真菌所產生的黃曲霉素具有高致癌性、致病性，廣泛存在于玉米、花生、木耳、大豆等食品中，是威脅人類健康的首要真菌毒素［2-4］。黃曲霉素產毒真菌的快速檢測和防治是目前真菌毒素污染領域的研究熱點。當前對黃曲霉素產毒真菌的檢測主要依靠傳統的形態學或免疫學方法。傳統形態學方法主要基于菌株形態、生理特征等進行鑒別，耗時耗力，且需要的經驗性較強；免疫學方法主要依靠黃曲霉素的抗性特點進行檢測，檢測樣品需經純化、孵育等多個環節，檢測周期長、操作復雜［5-7］。分子生物學技術的發展為黃曲霉素產毒真菌的快速檢測提供了新途徑。孫長坡等［8］、MAHMOUD 等［9］，AHMAD 等［10］等分別基于RFLP、SSR、功能基因等對不同真菌進行了鑒定。多重聚合酶鏈式反應（PCR）法是指在同一反應體系中加入多對引物，同時檢測出2 種以上目的基因的方法，具有高效、快速、高通量等優勢［11-14］。從黃曲霉素的生物合成途徑分析，雜色曲霉B（VerB）、雜色曲霉1（Ver-1）是黃曲霉素產生的關鍵基因［15-19］，對這2 個基因進行及時檢測也是鑒定黃曲霉素產毒真菌的關鍵；ITS 基因是真菌通用基因，可通過該基因測序有效排除假陽性和假陰性。目前尚無針對以上3 種基因開展黃曲霉素產毒真菌的多重PCR 體系研究。DNA 質量是影響多重PCR 的主要因素，CTAB［20］、SDS［21］及相關改良方法是目前常用的總DNA 提取方法，不同研究對象常需采用相應提取方法方可獲得高質量總DNA。為此，本研究中擬在考察了最佳DNA 提取方式的基礎上，基于VerB，Ver-1，ITS 基因序列設計多重PCR 引物，建立黃曲霉素產毒真菌的多重PCR 檢測體系，為該類真菌的分子鑒定提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

儀器：MJ-150-II 型霉菌培養箱、HZQ-X300C 型恒溫振蕩器、DK-8D 型三孔電熱恒溫水槽（上海一恒科學儀器有限公司）；GenoSens 1850 型凝膠成像儀（北京勤翔生物技術有限公司）；NanoDrop 2000 型超微量分光光度計（美國Thermo Fisher 公司）；T100 型PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）；GNJS-Ⅱ型菌落計數器（上海谷寧儀器有限公司）。

試劑：dNTP、Taq 酶、DNA Marker 及真菌、植物基因組DNA 提取試劑盒，均購自上海生工生物技術有限公司（批號分別為GA14KA7272，AK71529A，H701KA0592，H111KA8418，GB16KA7790）。細菌瓊脂粉、胰蛋白胨、葡萄糖、酵母浸粉、馬鈴薯-葡萄糖瓊脂（PDA）培養基、沙氏葡萄糖液體（SDB）培養基，均購自杭州水露生物科技有限公司。

菌株：包括黃曲霉Aspergillus flavus AS 3.3554、寄生曲霉 Aspergillus parasiticus AS 3.124、土曲霉Aspergillus terreus AS 3.3935、雜色曲霉Aspergillus versicolor AS 3.3886、紅曲霉Monascus sp AS 3.782、煙曲霉Aspergillus fumigatus AS 3.3572、毛 霉 Mucor AS 3.3447、鏈格孢霉Alternaria AS 3.4255、青霉Penicillium expansum AS 3.3875、黑曲霉Aspergillus niger CMCC（F）98003 和構巢曲霉Aspergillus nidulans AS 3.3916，均購自杭州水露生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養

將1.1 項下11 種菌株分別接種于PDA 培養基上，28 ℃培養箱中活化培養5～7 d，以菌落計數器觀察各菌株的生長情況。

1.2.2 不同DNA 提取方法考察

提取試劑盒考察：分別用Ezup 柱式植物基因組DNA 抽提試劑盒、Ezup 柱式真菌基因組DNA 抽提試劑盒提取各菌株DNA，各菌株DNA 采用液氮研磨的取材方式，以DNA 瓊脂糖凝膠電泳結果和ITS 基因序列結果評價提取試劑盒的優劣。

處理方式考察：采用提取效果較優的試劑盒，評價DNA 不同取材方式對總DNA 提取的影響。即對平皿培養后的菌落采取以下3 種取材方式，直接將菌絲從平皿上刮下，放入2 mL 離心管中，進行DNA 提取；用提取試劑盒中的buffer PCB 將斜面培養的菌絲溶解，取溶解液適量置2 mL 離心管中，進行DNA 提取；平皿上的菌絲轉移至研缽內，液氮研磨后再用試劑盒提取。總DNA 提取產物用1%瓊脂糖凝膠電泳驗證。

1.2.3 目標基因引物設計與擴增

根據Ver-1，VerB，ITS 序列，通過引物設計軟件Primer 5.0 設計相對應的多重PCR 引物（見表1），引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 黃曲霉素產毒真菌的多重PCR 目標基因及引物Tab.1 Multiplex PCR target genes and primers of aflatoxigenic fungi

1.2.4 單重PCR 檢測的特異性與靈敏度測定

PCR 反應體系：10.0 μL 5 ×PCR buffer，5.0 μL 10 mmol／L dNTP，5 μmol／μL 引物2 μL，4 μL 25 mmol／L MgCl2，0.5 μL Taq 酶（5 U ／ μL），1 μL DNA模板（10 ng／μL），加ddH2O 至50 μL。PCR 反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測產物純度。

以1.1 項下11 種菌株的DNA 為模板，在不同反應管中分別擴增Ver-1（800 bp）、VerB（1 000 bp）、ITS（600 bp）目標基因片段，測定單基因PCR 的特異性。以濃度確定的黃曲霉菌株基因組DNA（20 ng／μL）為模板，按質量濃度1 pg／μL～10 ng／μL 進行梯度稀釋，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測單基因PCR 擴增的靈敏性。

1.2.5 多重PCR 特異性與靈敏性測定

以1.1 項下11 種菌株的DNA 為模板，在同一反應管中同時進行Ver-1（800 bp）、VerB（1 000 bp）、ITS（600 bp）目標基因片段的擴增，測定多重PCR 的特異性。以濃度確定的黃曲霉菌株基因組DNA（20 ng／μL）為模板，依次稀釋至10，1 ng／μL，100，10，1，0.1 pg／μL，然后分別經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測多重PCR 擴增的靈敏度。

1.2.6 多重PCR 檢測的重復性與穩定性測定

平行提取3 份黃曲霉菌株DNA，按上述條件進行單管多重PCR 擴增，驗證體系的重復性；分別在第1，4，7 天用同一份黃曲霉菌株DNA 進行單管多重PCR 檢測，驗證體系的穩定性。

2 結果

2.1 菌株培養

各菌株培養結果見圖1。

2.2 DNA 提取方法比較

試劑盒優選：將1.1 項下11 種菌株用液氮研磨后，分別采用Ezup 柱式真菌基因組抽提試劑盒和Ezup 柱式植物基因組抽提試劑盒進行總DNA 的提取。結果采用真菌基因組抽提試劑盒的DNA 條帶顯示率為100%，采用植物基因組抽提試劑盒的DNA 條帶顯示率為50%（見圖2）；以真菌共有ITS 序列為目標基因，進行PCR擴增，結果采用真菌基因組抽提試劑盒的ITS 擴增率為100%，而采用植物基因組抽提試劑盒，ITS 擴增率為66.7%（見圖3）。故選用真菌基因組抽提試劑盒提取。

A.黑曲霉 B.青霉 C.毛霉 D.寄生曲霉 E.紅曲霉 F.黃曲霉 G.雜色曲霉 H.煙曲霉 I.土曲霉 J.構巢曲霉 K.鏈格孢霉圖1 各菌株培養結果（×100）A.Aspergillus niger B.Penicillium expansum C.Mucor D.Aspergillus parasiticus E.Monascus F.Aspergillus flavus G.Aspergillus versicolor H.Aspergillus fumigatus I.Aspergillus terreus J.Aspergillus nidulans K.AlternariaFig.1 Culture results of each strain（×100）

A.Ezup 柱式真菌基因組抽提試劑盒 B.柱式植物基因組抽提試劑盒Marker圖2 兩種不同試劑盒DNA 瓊脂糖凝膠圖像A.Ezup column fungal genome extraction kit B.Column plant genome extraction kit MarkerFig.2 DNA agarose gel images of two different kits

取材方式：采用Ezup 柱式真菌基因組抽提試劑盒提取各菌的DNA，按1.2.2 項下方法處理樣品。結果第1 種取材方式總DNA 直接電泳，條帶顯示率為16.7%，第2 種為50.0%，第3 種為100.0%（見圖4）；以真菌共有ITS 序列為目標基因進行擴增，結果第1 種取材方式ITS 擴增率為75.0%，第2 種為91.7%，第3 種為100.0%（見圖5）。故選用液氮研磨法處理樣品。

2.3 單重PCR 檢測特異性與基因序列比對

將11 種 菌株的DNA 用3 個引物（ITS，Ver-1，VerB）進行PCR 擴增后，僅黃曲霉和寄生曲霉出現3 個條帶，分別為600，800，1 000 bp 的特異片段，其余9 種僅獲得600 bp 的特異片段，詳見圖6。

測序后與GenBank 中已知基因序列對比（見圖7），可見600，800，1 000 bp 片段分別對應的是各菌株的ITS 片段、黃曲霉和寄生曲霉的Ver-1 與VerB 基因序列，表明針對目的DNA 片段檢測的引物設計成功。

2.4 多重PCR 檢測的特異性及靈敏性

特異性分析：將1.1 項下11 種菌株以液氮研磨處理，按1.2.4 項下方法擴增（圖8 A）。黃曲霉、寄生曲霉是已知可產毒的菌株，均出現了3 個條帶（泳道1 和2），除了構巢曲霉ITS 條帶較弱以外，其余菌株均僅出現了1 個明亮的ITS 條帶（泳道3～11）。

靈敏性分析：將已知濃度的黃曲霉DNA 進行梯度稀釋（0.1 pg／μL～10 ng ／ μL），按1.2.4 項下方法擴增（見圖8 B）。結果表明，在DNA 質量濃度達到1 ng／μL 時，出現明亮的多重條帶（泳道5）；而DNA 質量濃度在0.1 ng／μL 時，ITS 條帶亮度很弱，另外2 個目標條帶則完全不顯現（泳道4）。

A.第1 種 B.第2 種 C.第3 種圖5 不同取材方式下各菌株的ITS 圖像A.The first kind B.The second kind C.The third kindFig.5 ITS images of each strain under different sampling methods

1.ITS 2.Ver-1 3.VerB圖6 11 種菌株3 個目的基因單重PCR 檢測結果1.ITS 2.Ver-1 3.VerBFig.6 Single PCR detection results of target genes of 11 strains

2.5 多重PCR 檢測的重復性與穩定性

平行提取3 份黃曲霉的DNA，進行多重PCR 檢測（圖9 A）。取同1 份黃曲霉總DNA，分別在第1，4，7 天進行PCR 檢測（圖9 B）。結果表明，所建立的體系連續3 次檢測結果一致，且在7 d 內穩定性良好。

3 討論

3.1 DNA 提取方式對多重PCR 體系的影響

DNA 質量對多重PCR 結果的影響較大，常用的DNA 提取方式有CTAB 法、SDS 法、改良SDS 法等，本研究中根據DNA 提取方式的不同，考察了2 種提取試劑盒，發現以CTAB 法為原型的Ezup 柱式提取試劑盒所提取的DNA 效果更佳。

以真菌為原材料的DNA 提取主要有菌株凍干粉直接提取、菌株復蘇培養后收集菌絲體提取、菌株培養后菌絲體用液氮研磨后提取等多種方式，本研究中對不同提取方式均進行了嘗試，結合實際發現，菌株用平皿擴大培養后，刮取菌落用液氮研磨后再提取DNA，所得總DNA 質量最佳。原因可能是真菌的細胞裂解程度相關，液氮冷凍處理后，再加裂解液水浴，可顯著提高細胞破碎度、增加DNA 溶出率，從而提高DNA 產量。

3.2 引物設計對多重PCR 體系的影響

在進行黃曲霉素產毒真菌的檢測中發現，若想獲得高靈敏度、高重復性、高穩定性的PCR 體系，優質、合適的引物也是關鍵。本研究初期共設計了20 對引物，通過單重PCR 篩選，最終獲得3 條最佳引物。在引物設計中，將引物長度控制在18～27 bp、產物長度控制在200～500 bp、引物GC 含量控制在40%～60%，并盡量減少引物二聚體的形成和發卡結構的形成，可有效提高引物有效性和特異性。

A.ITS B.Ver-1 C.VerB圖7 基因序列比對結果A.ITS B.Ver-1 C.VerBFig.7 Results of gene sequence alignment

綜上所述，本研究中設計的引物具有良好的特異性，且引物靈敏度較高，平行重復3 次，均可呈現明亮條帶，7 d 內穩定性良好。這說明建立的多重PCR體系具有較好的適用性，可用于后續黃曲霉素產毒真菌的檢測。

A.特異性 B.靈敏性注：圖A 中，1-11 分別為黃曲霉、寄生曲霉、土曲霉、雜色曲霉、紅曲霉、煙曲霉、毛霉、鏈格孢酶、青霉、黑曲霉、構巢曲霉；圖B 中1-6 分別為0.1，1，10，100 pg／μL，1，10 ng／μL。圖8 多重PCR 檢測各菌株基因組基因特異性與靈敏性檢測A.Specificity B.SensitivityNote：In Fig.A，1 -11 respectively represent Aspergillus flavus，Aspergillus parasiticus，Aspergillus terreus，Aspergillus versicolor，Monascus，Aspergillus fumigatus，Mucor，Alternaria，Penicillium expansum，Aspergillus niger and Aspergillus nidulans；In Fig.B，1-6 respectively represent 0.1 pg／μL，1 pg／μL，10 pg／μL，100 pg／μL，1 ng／μL，10 ng／μL.Fig.8 Multiplex PCR detection of gene specificity and sensitivity of each strain genome

A.重復性 B.穩定性注：圖A 中，1～3 分別表示平行提取的3 份黃曲霉DNA 樣品，圖B 中，1～3 分別表示第1、4、7 天用同一份DNA 進行多重PCR。圖9 多重PCR 檢測的重復性與穩定性A.Repeatability B.StabilityNote:In Fig.A，1-3 respectively represent the three Aspergillus flavus DNA samples extracted in parallel，and in Fig.B，1-3 respectively represent the multiplex PCR with the same DNA on day 1，4 and 7.Fig.9 Repeatability and stability of multiplex PCR detection