安腸膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究*

覃 翔，林憶龍，陳 壯，李婉銘，韋孌靜，廖 強(qiáng)

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011；2.桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541100；3.廣西壯族自治區(qū)南寧市食品藥品檢驗所，廣西 南寧 530004）

安腸膠囊為廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院院內(nèi)制劑（桂藥制字Z01060154），由黃芪、白頭翁、補(bǔ)骨脂、白術(shù)、（熟）附子、檳榔等組方，具有健脾益氣、溫補(bǔ)脾腎、清腸祛濕、行氣導(dǎo)滯功效，用于治療慢性、潰瘍性結(jié)腸炎［1］，療效確切［2］，使用安全。但現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅規(guī)定其檢查項，尚無質(zhì)量控制項。本研究中增加了黃芪、白頭翁、補(bǔ)骨脂、白術(shù)的薄層色譜（TLC）鑒別，檢查了烏頭堿限量，并建立了測定黃芪中指標(biāo)性成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的高效液相色譜（HPLC）法?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-2030（Plus）型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司），配有真空脫氣機(jī)、四元泵、自動進(jìn)樣器、紫外檢測器；VGT-2227QTD 型超聲波清洗機(jī)（廣東固特超聲股份有限公司）；WFH-205B 型可見透身紫外反射儀（上海精科實業(yè)有限公司）；XS205DU 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度0.01 mg）；101-38 型數(shù)顯式電熱恒溫干燥箱（上海滬越實驗儀器有限公司）；定量毛細(xì)管（德國赫施曼實驗室儀器公司，規(guī)格為1，2，5，10 μL）；硅膠G 薄層板（批號為20200507），硅膠GF254薄層板（批號為20200903），規(guī)格10 cm×10 cm，購自青島海洋化工有限公司（廠家A）；硅膠G 薄層板（批號為20191220），硅膠GF254薄層板（批號為20190816），規(guī)格10 cm×10 cm，購自煙臺市化學(xué)工業(yè)研究所（廠家B）。

1.2 試藥

安腸膠囊（廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院制劑室，批號分別為20190815，20191122，20200108，20200326，20200608，20200923）；附子（黑順片，批號為20201101），白頭翁（批號為20190601），均購自廣西仙茱中藥科技有限公司；黨參（批號為20201127），干姜（批號為20200901），黃芪（批號為20201124），檳榔（批號為20191016），補(bǔ)骨脂（批號為20200701），白術(shù)（批號為20200212），茯苓（批號為20200824），甘草（批號為20200623），均購自廣西柳州百草堂中藥飲片廠有限責(zé)任公司；木香（批號為20190401），雞內(nèi)金（批號為20190803），均購自廣西德潤堂中藥科技有限公司；黃芪甲苷對照品（批號為110781-201717，含量為96.9%），白頭翁皂苷B4對照品（批號為111766-201702，含量為96.4% ），異補(bǔ)骨脂素對照品（批號為110738-202016，含量為99.4%），烏頭雙酯型生物堿對照品（批號為112029-201601，含新烏頭堿31.7%、次烏頭堿30.0%、烏頭堿31.8%），毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（批號為110703-201731，含量為97.6%），白術(shù)對照藥材（批號為120925-201812），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC 鑒別

黃芪［3］：取樣品內(nèi)容物5 g，加甲醇30 mL，超聲（功率為600 W，頻率為40 kHz，下同）處理20 min，放冷，濾過，濾液揮干，殘渣加水20 mL 使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取2 次，各20 mL，棄去水液，合并正丁醇液；用1%氫氧化鈉溶液洗滌2 次，各20 mL，棄去堿水液，合并正丁醇液；用正丁醇飽和水溶液洗滌2 次，各20 mL棄去水液，揮干處理后的正丁醇液，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg／mL 的對照品溶液。按處方工藝稱取缺黃芪的其余藥材，制備缺黃芪的陰性樣品，取5 g，同供試品溶液制備方法制備缺黃芪的陰性對照品溶液。精密吸取上述溶液各4 μL，依次點于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯-三氯甲烷-甲醇-水（8 ∶4 ∶5 ∶2，V／V／ V／ V）于10 ℃下放置1 h 后的下層溶液為展開劑，于30 ℃下展開8 cm，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光（365 nm）燈下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點，斑點比移值適中，且陰性對照無干擾。色譜圖見圖1。

1 -3.供試品溶液（批號分別為20200326，20200608，20200923）4.對照品溶液 5.陰性對照品溶液A.相對濕度為55%（廠家A）B.相對濕度為57%（廠家B）圖1 黃芪薄層色譜圖1 -3.Test solution（batch No.：20200326，20200608，20200923）4.reference solution 5.negative reference solutionA.The relative humidity is 55%（manufacturer A）B.The relative humidity is 57%（manufacturer B）Fig.1 TLC chromatograms of Astragali Radix

白頭翁：取樣品內(nèi)容物3 g，加甲醇20 mL，超聲處理20 min，放冷，濾過，濾液揮干，殘渣加水20 mL 使溶解，用水飽和的正丁醇溶液振搖提取2 次，各20 mL，棄去水液，合并正丁醇液，揮干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。取白頭翁皂苷B4對照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.5 mg／mL 的對照品溶液。按處方工藝稱取缺白頭翁的其余藥材，制備缺白頭翁的陰性樣品，取3 g，同供試品溶液制備方法制備缺白頭翁的陰性對照品溶液。精密吸取上述溶液各2 μL，依次點于同一硅膠G 薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（6 ∶2 ∶1，V／ V／ V）為展開劑，于30 ℃下展開8 cm，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，斑點比移值適中，且陰性對照無干擾。色譜圖見圖2。

補(bǔ)骨脂：取樣品內(nèi)容物5 g，加乙酸乙酯30 mL，超聲處理20 min，放冷，濾過，濾液揮干，殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為供試品溶液。取異補(bǔ)骨脂素對照品，加乙酸乙酯制成質(zhì)量濃度為2 mg／mL 的對照品溶液。按處方工藝稱取缺補(bǔ)骨脂的其余藥材，制備缺補(bǔ)骨脂的陰性樣品5 g，同供試品溶液制備方法制備缺補(bǔ)骨脂的陰性對照品溶液。精密吸取供試品溶液、陰性樣品溶液各8 μL，對照品溶液2 μL，依次點于同一硅膠G 薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（4 ∶1，V／ V）為展開劑，于30 ℃下展開8 cm，取出，晾干，噴以10%氫氧化鉀甲醇溶液，置紫外光（365 nm）燈下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點，斑點比移值適中，陰性對照無干擾。色譜圖見圖3。

1 -3.供試品溶液（批號分別為20200326，20200608，20200923）4.對照品溶液 5.陰性對照品溶液A.相對濕度為46%（廠家A）B.相對濕度為52%（廠家B）圖2 白頭翁薄層色譜圖1 -3.test solution（batch No.:20200326，20200608，20200923）4.reference solution 5.negative reference solutionA.The relative humidity is 46%（manufacturer A）B.The relative humidity is 52%（manufacturer B）Fig.2 TLC chromatograms of Pulsatillae Radix

1 -3.供試品溶液（批號分別為20200326，20200608，20200923）4.對照品溶液 5.陰性對照品溶液A.相對濕度為41%（廠家A）B.相對濕度為45%（廠家B）圖3 補(bǔ)骨脂薄層色譜圖1 -3.test solution（batch No.:20200326，20200608，20200923）4.reference solution 5.negative reference solutionA.The relative humidity is 41%（manufacturer A）B.The relative humidity is 45%（manufacturer B）Fig.3 TLC chromatograms of Psoraleae Fructus

白術(shù)［4］：取樣品內(nèi)容物5 g，用石油醚（30～60 ℃）振搖提取2 次，各30 mL，合并提取液，揮干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。取白術(shù)對照藥材2 g，加正己烷20 mL，超聲處理15 min，放冷，濾過，濾液揮干，殘渣加正己烷1 mL 使溶解，作為對照藥材溶液。按處方工藝稱取缺白術(shù)的其余藥材，制備缺白術(shù)的陰性樣品，取5 g，同供試品溶液制備方法制備缺白術(shù)的陰性對照品溶液。精密吸取供試品溶液、陰性樣品溶液各8 μL，對照藥材溶液10 μL，依次點于同一硅膠GF254薄層板上，使成條帶狀，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（5 ∶2，V／ V）為展開劑，于30 ℃下展開8 cm，取出，晾干，置紫外光（254 nm）燈下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光淬滅主斑點，斑點比移值適中，且陰性對照無干擾。色譜圖見圖4。

1 -3.供試品溶液（批號分別為20200326，20200608，20200923）4.對照藥材溶液 5.陰性對照品溶液A.相對濕度為65%（廠家A）B.相對濕度為60%（廠家B）圖4 白術(shù)薄層色譜圖1 -3.test solution（batch No.：20200326，20200608，20200923）4.reference medicinal material solution 5.negative reference solutionA.The relative humidity is 65%（manufacturer A）B.The relative humidity is 60%（manufacturer B）Fig.4 TLC chromatograms of Atractylodis Macrocephalae Rhizoma

附子（烏頭堿限量）：取樣品內(nèi)容物3 g，加氨試液3 mL 潤濕，加乙醚25 mL，超聲處理30 min，放冷，濾過，濾液揮干，殘渣加二氯甲烷0.5 mL 使溶解，作為供試品溶液。取烏頭雙酯型生物堿對照品適量，加異丙醇-二氯甲烷（1 ∶1，V／ V）混合液制成質(zhì)量濃度為1 mg／mL的對照品溶液。取供試品溶液、對照品溶液各10 μL，依次點于同一硅膠G 薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇（64 ∶36 ∶10，V／ V／ V）為展開劑，置氨蒸氣中預(yù)飽和20 min 的展開缸內(nèi)，30 ℃下展開8 cm，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液，置日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上無相同顏色的斑點顯現(xiàn)；對照品溶液色譜中，斑點比移值由大到小依次為次烏頭堿、烏頭堿、新烏頭堿。色譜圖見圖5。

2.2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Shim-pack GIST C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（程序見表1）；流速：1.0 mL／min；柱溫：30 ℃；檢測波長：260 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序（%）Tab.1 Gradient elution program of mobile phase（%）

2.2.2 溶液制備

取樣品膠囊內(nèi)容物5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，取出，放冷，稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻濾過，濾液揮干，殘渣加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，用微孔濾膜（0.22 μm）濾過，即得供試品溶液。取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度為18.74 μg／mL 的對照品溶液。按處方工藝稱取缺黃芪的其余藥材，制備缺黃芪的陰性樣品，取5 g，同供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

1 -3.供試品溶液（批號分別為20200326，20200608，20200923）4.對照品溶液A.相對濕度為50%（廠家A）B.相對濕度為53%（廠家B）圖5 烏頭堿薄層色譜圖1 -3.test solution（batch No.：20200326，20200608，20200923）4.reference solutionA.The relative humidity is 50%（manufacturer A）B.The relative humidity is 53%（manufacturer B）Fig.5 TLC chromatograms of aconitine

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：取2.2.2 項下對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各適量，按2.2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液色譜圖中，在與毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液色譜相同保留時間處有相應(yīng)色譜峰出現(xiàn)，且陰性對照無干擾。理論板數(shù)按毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰計大于3 000。色譜圖見圖6。

線性關(guān)系考察：精密量取2.2.2 項下對照品溶液4，6，8，10，12，14 μL，按2.2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，以毛蕊異黃酮葡萄糖苷的進(jìn)樣量（X，ng）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y ＝3 452.23 X+95.511 7（R2＝1.000 0，n ＝6）。結(jié)果表明，毛蕊異黃酮葡萄糖苷進(jìn)樣量在74.96～262.36 ng 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：取2.2.2 項下對照品溶液（質(zhì)量濃度為18.74 μg／mL）適量，按2.2.1 項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次。結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的RSD為0.13%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一批（批號為20200608）樣品，依法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，24 h 時按2.2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的RSD 為0.31%（n ＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：取同一批（批號為20200608）樣品內(nèi)容物適量，依法平行制備供試品溶液6 份，按2.2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷的平均含量為31.94 ng／g，RSD 為0.75%（n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的同一批（批號為20200608）樣品內(nèi)容物適量，精密稱定，共6 份，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液1 mL，分別精密加入質(zhì)量濃度為18.74 μg／mL 的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液各1 mL，制備加樣供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗結(jié)果（n ＝6）Tab.2 Results of the recovery test（n ＝6）

2.2.4 樣品含量測定

取6 批（批號分別為20190815，20191122，20200108，20200326，20200608，20200923）樣品，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，并計算含量。結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷的平均含量為31.58 μg／g，RSD 為1.97%（n ＝6）。

1.毛蕊異黃酮葡萄糖苷A.對照品溶液 B.供試品溶液 C.陰性對照品溶液圖6 專屬性試驗高效液相色譜圖1.calycosin-7 -glucosideA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms of the specificity test

3 討論

3.1 指標(biāo)性成分選擇

安腸膠囊方中，黃芪健脾益氣，為主藥。2020 年版《中國藥典（一部）》［5］中黃芪項下規(guī)定，黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷為含量測定指標(biāo)。而黃芪甲苷因無紫外吸收，故以毛蕊異黃酮葡萄糖苷為指標(biāo)性成分進(jìn)行含量測定。

3.2 TLC 條件選擇

黃芪：以黃芪甲苷為指標(biāo)性成分進(jìn)行定性鑒別，采用2020 年版《中國藥典（一部）》［5］中的方法鑒別時，供試品溶液色譜背景干擾較深，斑點分離度較差。故選用水飽和的正丁醇液萃取，以堿性溶液洗滌，去除雜質(zhì)成分，提高黃芪甲苷含量。結(jié)果斑點清晰，分離度好，陰性對照無干擾。

白頭翁：采用2020 年版《中國藥典（一部）》［5］中的方法鑒別時，供試品溶液色譜背景干擾較深，斑點分離度較差，且對照品溶液斑點的比移值較大。由于白頭翁主要成分為三萜皂苷［6］，極性較大，故選用水飽和的正丁醇液萃取，并將展開劑正丁醇-冰醋酸-水的比例由4 ∶1 ∶2（V／ V／ V）調(diào)整至6 ∶2 ∶1（V／ V／ V），使極性降低，以去除雜質(zhì)成分，調(diào)整斑點位置。結(jié)果斑點清晰，分離度好，比移值適中，陰性對照無干擾。

附子：方中附子為黑順片，采用2020 年版《中國藥典（一部）》中附子項下TLC 法［5］檢查烏頭堿的限量，選取烏頭雙酯型生物堿對照提取物為對照品，結(jié)果供試品溶液色譜中未檢出烏頭雙酯型生物堿，可確保本制劑的用藥安全。

3.3 HPLC 條件選擇

色譜柱選擇：曾考察島津、Waters、Agilent 等不同廠家的色譜柱，發(fā)現(xiàn)島津Shim-pack GIST C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）分離效果最好，重復(fù)性良好。

流動相選擇：曾考察乙腈-水、乙腈-0.1%冰醋酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液4 個流動相體系［7］。結(jié)果以乙腈-水為流動相時，峰形不對稱，有拖尾現(xiàn)象；以乙腈-0.1%冰醋酸溶液為流動相時，基線波動較大；以乙腈-0.1%甲酸溶液為流動相時，色譜峰數(shù)量減少且響應(yīng)值降低；以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相時，基線平穩(wěn)，色譜峰數(shù)量多且響應(yīng)值高，峰形對稱。故選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相。同時考察流動相梯度洗脫比例，結(jié)果選取2.2.1 項下洗脫程序時，色譜峰保留時間適宜，分離度均大于1.5，理論板數(shù)符合要求。

供試品溶液制備方法選擇：曾考察水、50%甲醇、80%甲醇、甲醇4 種提取溶劑［8］，結(jié)果以甲醇為提取溶劑提取時目標(biāo)成分含量最高，提取效果最佳，故選擇甲醇?？疾炝思訜峄亓鳌⒊曁幚? 種提取方法，結(jié)果2 種提取方法對目標(biāo)成分含量影響不大，為保證提取完全與試驗操作的方便性，選擇超聲提取。考察了30，60，90 min 3 種提取時間，結(jié)果提取30 min 時已接近提取完全，故選擇提取時間為30 min。

樣品含量測定方法選擇：由于制劑的生產(chǎn)批次有限，僅選用近1 年的6 個批次的樣品進(jìn)行含量測定，結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量范圍波動較小，質(zhì)量較穩(wěn)定。但本研究中樣本量不足，難以制訂其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測定的控制限度，后期研究考慮收集18 個月內(nèi)生產(chǎn)的不同批次的樣本。

3.4 方法評價

本研究中建立的方法操作簡便快捷，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，專屬性強(qiáng)，重復(fù)性和穩(wěn)定性均較好，能更全面地控制安腸膠囊的質(zhì)量。