超高效液相色譜串聯質譜法同時測定腸瘍消丸中綠原酸和毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量*

張煜帆，余潔真，池浩波，陸湘樺，佘溢彬

（廣東省潮州市藥品檢驗所，廣東 潮州 521000）

腸瘍消丸為潮州市中醫院的醫院制劑，由黃芪、黃連、金銀花等16 味中藥組方，主要功效為疏肝健脾、理氣止痛、利濕止瀉、收斂生肌，治療慢性潰瘍性結腸炎等的療效顯著。其原有質量標準起草時間早，尚未建立有效成分的含量測定方法，質量控制缺少重要依據，有必要加以改進。黃芪和金銀花作為方劑中的君藥和臣藥，其活性成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷和綠原酸具有一定抗炎作用［1-2］。毛蕊異黃酮葡萄糖苷屬黃酮類化合物，有抗病毒、調節免疫系統等作用［3-4］，可抑制潰瘍性結腸炎模型小鼠大腸組織中炎性因子mRNA 的表達及炎性因子水平的升高，對潰瘍性結腸炎療效明確［5-6］。綠原酸為金銀花的主要活性成分，有抗菌、抗氧化、強化機體免疫功能等作用［7-8］，能較好地緩解三硝基苯磺酸（TNBS）誘導的結腸炎大鼠的腸黏膜損傷，保護腸道的屏障作用［9］。腸瘍消丸的成分繁多，普通高效液相色譜（HPLC）法對復雜樣品多組分的分離有局限性，極性相似的組分易相互干擾，不易分離，影響定性定量的準確性。超高效液相色譜串聯質譜（UHPLC-MS／MS）法通過對母離子和子離子的質量篩選，能很好地對目標組分進行定性和定量分析，可獲得更準確的結果［10-11］。本研究中建立了同時測定腸瘍消丸中綠原酸和毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的UHPLC-MS／MS 法，現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Triple Quad 3500 型三重四極桿超高效液相色譜-質譜聯用儀（美國AB SCIEX 公司）；XS205DU 型十萬分之一天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；Fotector-04HT 型固相萃取儀（睿科儀器有限公司）；PS-80A 型超聲波清洗器（東莞市潔康超聲波設備有限公司）。

1.2 試藥

腸瘍消丸（潮州市中醫院，批號分別為20180612，20181209，20190325）；綠原酸對照品（批號為110753-201716，含量為99.3%），毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（批號為111920-201907，含量為96.8%），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、甲酸均為分析純，乙腈為色譜純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 試驗條件

色譜條件：ThermosHypersilGOLD色譜柱（150mm×3mm，3 μm）；固相萃取小柱［Waters Oasis HLB 3cc（60 mg）］；流動相：0.3% 甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～3 min 時5%B，3～7 min 時100%B，7～9 min 時5%B）；流速：0.2 mL／min；柱溫：40 ℃；進樣量：1 μL。

質譜條件：電噴霧離子源（ESI）；多反應監測模式的參數見表1；正離子掃描；離子源電壓：4 500 V；霧化器溫度：500 ℃；氣簾氣：40 psi；碰撞氣：9 psi；噴霧氣30 psi；輔助加熱氣：20 psi。

表1 主要成分多反應監測參數Tab.1 MRM parameters of main components

2.2 溶液制備

供試品溶液：取樣品粉末約0.5 g，精密稱定，置100 mL 錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質量，超聲（功率480 W，頻率40 kHz）提取30 min，放冷，再次稱定質量，用甲醇補足減失的質量，12 500 r／min 離心15 min，取上清液，即得供試品溶液（純化前）。精密量取20 mL，經自動固相萃取儀（主要參數見表2），用HLB 固相萃取小柱純化收集，濃縮并定容至5 mL；即得供試品溶液（純化后）。

1，3.綠原酸 2，4.毛蕊異黃酮葡萄糖苷A.一級質譜 B.二級質譜圖1 對照品多反應監測質譜圖1，3.chlorogenic acid 2，4.calycosin-7 -glucosideA.Primary mass spectrometry B.Secondary mass spectrometryFig.1 MRM chromatograms of reference substance

表2 固相萃取儀主要參數Tab.2 Main parameters of solid phase extractor

對照品溶液：取綠原酸對照品適量，精密稱定，以甲醇溶解，制成質量濃度為120.8 μg／mL 的對照品貯備液A。取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品適量，精密稱定，以甲醇溶解，制成質量濃度為2.570 μg／mL 的對照品貯備液B。各精密量取適量置容量瓶中，用甲醇稀釋，得綠原酸質量濃度為1.208，2.416，4.832，12.080，24.160，60.400 μg／mL，毛蕊異黃酮葡萄糖苷質量濃度為0.025 7，0.051 4，0.102 8，0.257 0，0.513 9，1.285 0 μg／mL 的混合對照品溶液（記為S1，S2，S3，S4，S5，S6）。

空白對照溶液：以甲醇作為空白對照溶液。

2.3 方法學考察

A.空白對照溶液 B.混合對照品溶液 C.供試品溶液（純化前）D.供試品溶液（純化后）圖2 UHPLC-MS／MS 圖A.Blank reference solution B.Mixed reference solution C.Test solution（before purification）D.Test solution（after purification）Fig 2 UHPLC-MS／MS chromatograms

系統適用性試驗：取2.2 項下混合對照品溶液、供試品溶液（純化前、純化后）、空白對照溶液各適量，按2.1 項下試驗條件進樣，記錄信號強度（見圖2）。結果顯示，供試品溶液與混合對照品溶液在相同時間處有相應峰，陰性對照無干擾，且純化后的供試品溶液雜質顯著減少。

線性關系考察：取2.2 項下混合對照品溶液，按2.1 項下試驗條件進樣測定，以綠原酸和毛蕊異黃酮葡萄糖苷質量濃度為橫坐標、信號強度為縱坐標進行線性回歸。結果見表3。

表3 各組分線性關系考察結果（n ＝5）Tab.3 Results of the linear relation test of each component（n ＝5）

精密度試驗：取2.2 項下混合對照品溶液S4，按2.1 項下試驗條件連續進樣測定6 次，記錄毛蕊異黃酮葡萄糖苷、綠原酸信號強度。結果的 RSD 分別為1.91%，2.79%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取樣品粉末（批號為20180612）適量，精密稱定，按2.2 項下方法制備供試品溶液，室溫下放置0，2，4，6，8，12，24 h 時按2.1 項下試驗條件進樣測定，記錄毛蕊異黃酮葡萄糖苷、綠原酸信號強度。結果的RSD 分別小于1.80%和2.30%（n ＝7），表明室溫下供試品溶液放置24 h 內穩定。

重復性試驗：取同一批（批號20180612）樣品，按2.2 項下方法平行制備供試品溶液6 份，按2.1 項下試驗條件進樣測定，記錄信號強度并計算毛蕊異黃酮葡萄糖苷和綠原酸含量。結果的RSD 分別為3.48% 和2.89%（n ＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取同一批（20190325）樣品約6 g（1 次服用量），粉碎，平行稱取藥品粉末6 份，精密稱定，分別加入2.2 項下對照品貯備液A 和對照品貯備液B 各1 mL，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下試驗條件進樣測定，記錄信號強度，并計算加樣回收率。結果見表4。

表4 加樣回收試驗結果（n ＝6）Tab.4 Results of the recovery test（n ＝6）

2.4 樣品含量測定

取3 批樣品，按2.2 項下方法制備供試品溶液，每個樣品平行進樣2 次，記錄信號強度，并計算綠原酸和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量。結果見表5。

表5 樣品中綠原酸和毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定結果（μg／g，n ＝2）Tab.5 Results of content determination of chlorogenic acid and calycosin-7 -glucoside in the sample（μg／g，n ＝2）

3 討論

3.1 檢測方法

毛蕊異黃酮葡萄糖苷和綠原酸均易溶于甲醇，故以甲醇作為溶劑有助于提高目標成分的提取率。上述成分的化學結構均存在共軛雙鍵，對紫外光譜有一定吸收，預試驗中曾選擇HPLC 法進行測定［12-14］。腸瘍消丸的處方中含有十幾味藥材，用甲醇提取的供試液成分較復雜，通過SPE 小柱萃取能有效減少供試品中的雜質。但由于紫外檢測器選擇性不高，各成分的色譜峰互相干擾嚴重，無法有效對目標成分進行分離。故本方法采用選擇性高的UHPLC-MS／MS 法，通過對母離子和子離子的篩選，建立離子對，同時對2 個目標成分進行更準確的定量分析。

3.2 測試條件

有文獻報道，測定毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量時正負離子模式可能與不同品牌的儀器有關［15-16］。預試驗中分別嘗試正負2 種模式對目標成分的測量條件進行優化，在負離子模式下，毛蕊異黃酮葡萄糖苷的響應較正離子模式弱。選擇［M+H］+的正離子模式時，毛蕊異黃酮葡萄糖苷和綠原酸的母離子和子離子均有較好的響應值，靈敏度較高，專屬性強，雜質干擾小，對色譜柱的分離要求相對較低，故選擇正離子掃描模式。

3.3 方法評價

本研究中成功建立了UHPLC-MS／MS 法同時測定腸瘍消丸中的綠原酸和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量，其操作方法簡便、快捷，分析時間短，分離效果好，靈敏度高，有利于控制和分析制劑質量。