不同臨床表現的諾如病毒感染患兒免疫功能探析

左娜穎 張遠達 董青偉 張思思 宋浩彬

諾如病毒（Norovirus，NoV）是病毒性急性腸胃炎的主要病原體之一[1]。諾如病毒感染分為有癥狀的和無癥狀的，約有30%的諾如病毒感染者無癥狀[2-3]。盡管癥狀性感染備受關注，但由于缺乏可用的諾如病毒感染動物模型，因此對癥狀性諾如病毒感染的原因了解甚少[4-5]。為了開發針對癥狀預防和預防感染更有效疫苗，需要更清楚地了解癥狀的潛在免疫學驅動因素。諾如病毒感染導致人體快速免疫反應，感染后24~48 h血清細胞因子升高，且可能與癥狀同時發生[6]。有研究認為有癥狀的感染是由免疫介導的損傷或病毒的直接活性引起的，然而病毒載量與癥狀之間相關聯的證據有限[7-8]。本研究通過比較有癥狀和無癥狀的個體在諾如病毒感染后血清細胞因子與每日病毒RNA滴度之間的變化，評估癥狀是否與免疫反應有關或者與病毒負荷量相關。

1 資料與方法

1.1 一般資料

于2018年5月—2019年3月共收集了在本院就診的100例疑似感染諾如病毒的患兒，經過確診感染共40例，其中27例出現癥狀，13例無癥狀。所有患兒的監護人均簽訂知情同意書，本研究同時經醫院倫理道德委員會審核通過。

納入標準：年齡＜14歲；糞便中可檢測到諾如病毒RNA的存在；體格正常。有癥狀感染者滿足以下條件之一：（1）僅腹瀉；（2）嘔吐或者并發其他一種癥狀（即腹部絞痛、惡心、口腔溫度≥37.6℃、肌痛、發冷、疲勞或頭痛）。糞便或嘔吐樣品可檢測到諾如病毒RNA但無明顯并發癥的兒童則為無癥狀感染者。排除標準：HIV血清學呈陽性；細菌或其他病毒感染呈陽性；肝或腎功能或血液指標異常；患有慢性疾病（即狼瘡、癌癥、腎臟疾病）或自身免疫學疾病。

1.2 病毒檢測方法

糞便和嘔吐樣品通過實時逆轉錄-定量聚合酶鏈反應（realtime quantitative polymerasechain reaction，RT-qPCR）進 行 測 試，其中至少有一個樣本通過RT-qPCR檢測到諾如病毒RNA陽性，則表明受試者感染諾如病毒。使用修正的Vesikari評分評估感染的嚴重程度[9]，并計算納入研究的所有個體的感染程度。

1.3 觀察指標

（1）分析患者一般資料；（2）比較兩組患兒細胞因子水平；由第三方檢測：包括干擾素IFN-α2、IFN-γ、白介素（IL）-1a、IL-1b、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、單核細胞趨化蛋白1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）、腫瘤壞死因子（tumour necrosis factor，TNF）-α和TNF-β。

1.4 統計學處理

用SPSS 20.0軟件進行數據整理、篩選與統計分析。計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，計數資料以率（%）表示，采用χ2檢驗。采用Pearson相關分析方法探討全體研究對象，有癥狀組及無癥狀組病毒RNA脫落天數及改良Vesikari評分與患者各細胞因子的相關性；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，計算病毒RNA中位脫落時間，采用Log-rank檢驗比較有癥狀組及無癥狀組的脫落預后的差異。采用0.05檢驗水準，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 有癥狀與無癥狀感染者基礎臨床特征分析

100例患兒中，40例確診為諾如病毒感染，有27例表現了臨床癥狀，兩組改良Vesikari評分差異有統計學意義（P＜0.05），其余指標差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 （續）

表1 有癥狀與無癥狀感染者基礎臨床特征分析

2.2 兩組患兒細胞因子水平比較

與無癥狀組相比，有癥狀組的IFN-γ、IL-1a、IL-1b、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-β具有較高的表達水平（P＜0.05），見表2。

表2 （續）

表2 兩組患兒細胞因子水平比較 （±s）

表2 兩組患兒細胞因子水平比較 （±s）

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2.3 細胞因子與病毒RNA脫落時間相關性分析

細胞因子與病毒脫落時間進行相關性分析，總體樣本與有癥狀組、無癥狀組相關性分析結果一致，有癥狀組、無癥狀組細胞因子水平變化均與病毒脫落時間無顯著相關性（P＞0.05）。

2.4 細胞因子與改良Vesikari評分相關性分析

相關性分析結果顯示，總體樣本與有癥狀組相關性分析結果一致，總體樣本及有癥狀組相關性分析表明，IFN-γ、IL-1b，IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-β、IL-1ra與 改 良Vesikari評分有顯著統計學相關性（P＜0.05），其余細胞因子與改良Vesikari評分無顯著統計學相關性（P＞0.05），見表3。

表3 （續）

表3 細胞因子與改良Vesikari評分相關性分析結果

2.5 有無癥狀患者病毒RNA脫落狀態及生存分析

兩組脫落率，差異無統計學意義（χ2=0.683，P=0.409），癥狀與病毒RNA脫落情況未見統計學相關，見表4；有癥狀中位脫落時間為25.00 d，無癥狀中位脫落時間為22.00 d，曲線未見顯著差異性，見圖1。

表4 有無癥狀患者病毒RNA脫落情況分析（KM）

圖1 生存曲線

3 討論

本研究結果表明，與無癥狀的個體相比，有癥狀的個體的血清中干擾素及白細胞介素的水平明顯更高。雖然已經有研究比較感染個體與未感染的個體對諾如病毒攻擊的免疫反應[6]。本研究首次對有癥狀感染和無癥狀感染進行了探索，發現在感染期間有癥狀的個體比無癥狀的個體具有更高的Th1和某些Th-2細胞因子及IL-8水平。輪狀病毒胃腸炎的研究發現，與健康對照和非病毒性腹瀉對照相比，血清TNF-α與腹瀉發病率顯著相關[10-11]。其他病毒感染包括乙型肝炎和登革熱病毒，與無癥狀個體相比，有癥狀的個體中誘導了不同的促炎細胞因子基因表達[12]。有癥狀的諾如病毒感染中存在血清細胞因子升高，因此表明在諾如病毒感染中癥狀可能是免疫介導的。

本次研究還發現IFN-γ、IL-1b、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-β、IL-1ra與改良Vesikari 評分具有相關性，同時與其他有關細胞因子水平研究結果類似[13]。鼠諾如病毒能夠抑制1型IFN的產生[14]。在本研究中也未觀察到1型IFN-α2的顯著升高，表明人諾如病毒可能具有機制。因此，這可能說明由于初始病毒控制不佳而導致病毒滴度高的個體可能對升高的促炎細胞因子有反應，以限制病毒復制。

已有研究結果表明，癥狀性感染及細胞因子與病毒脫落之間沒有顯著相關性[15]。本研究中測定了一些CD8+T細胞相關細胞因子（IFN-γ、IL-2、TNF-α）也未發現它們的水平與病毒脫落持續時間之間的任何關聯。

諾如病毒感染者的組織學研究和某些動物模型表明諾如病毒感染引起腸粘膜特別是上皮損傷，這種損害可能導致免疫激活[16]。但癥狀的原因尚不明確，有以下三種可能的假設。首先，癥狀可能是免疫激活的直接結果，輪狀病毒感染已表明血清細胞因子升高與癥狀性疾病有關，高水平的血清細胞因子和免疫激活可能導致嚴重的癥狀，包括嘔吐和腹瀉[17]。其次，癥狀可能是生理損傷的結果，可能與更大的病毒載量以及直接的病毒活性有關。最后，癥狀可能與所有三個中心變量（即病毒載量，損傷和免疫激活）有關，并且可能通過已知的其他因素改變免疫因素，例如遺傳學，免疫能力，以前曾接觸過類似菌株，生理因素或合并感染。

本研究具有不可避免的局限性，首先，納入的個體相對較少，限制了統計能力。其次，評估病毒脫落時可能出現測量錯誤。病毒滴度可能取決于糞便量，例如，高纖維飲食的個體可能比低纖維飲食個體的糞便產量更多，因此可能影響了最終病毒滴度的計算。雖然通過累積脫落來避免這種錯誤，但是在糞便保留或便秘的情況下，也可能會產生偏差。

綜上所述，有癥狀的個體比無癥狀的個體具有更高的血清細胞因子水平，且有無癥狀患者與每日病毒RNA滴度，病毒脫落持續時間或累積脫落時間無顯著關系。這些發現表明癥狀可能部分是由免疫介導的機制驅動的，而不是病毒的載量。