骨肉瘤中Circ_0104346的表達及對骨肉瘤細胞增殖的影響

柳勛法，張翠靈

1.深圳市人民醫院脊柱外科，廣東深圳 518020；2.深圳市人民醫院檢驗科，廣東深圳 518020

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）最常見的骨原發惡性腫瘤，在骨原發性腫瘤中，其發病率僅次于漿細胞骨髓瘤[1]，每年全世界的發病率為4人/百萬人[2]。手術和多藥聯合化療是骨肉瘤患者主要的治療方法?；熌芟麥缁颊唧w內潛在的微小轉移灶、使腫瘤體積變小、腫瘤局部血供減少、提高保肢手術成功率?；熉摵鲜中g治療能夠極大提高生存率，5年生存率從10%～20%上升到60%～70%。然而由于化療抵抗的產生和化療藥物的不良反應，超過80%的手術治療患者表現出轉移和局部復發，預后極差[3-4]。同時腫瘤細胞耐藥性不斷增強，越來越多的研究發現化療抵抗常常導致化療失敗，目前化療抵抗的具體機制仍未完全清楚。前期研究中發現，在骨肉瘤癌旁組織中Circ_010434高表達，但其機制及對骨肉瘤細胞的作用尚不明確[5-6]。該研究通過收集4種骨肉瘤細胞，包括MG-63、U2OS、SaOS-2和SOSP-9607，觀察Circ_010434對骨肉瘤細胞遷移及增殖的影響。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用的4款骨肉瘤細胞，包括MG-63、U2OS及SaOS-2購買自北納生物，SOSP-9607購買自中科院。

1.2 主要實驗試劑

①2×SYBR Green PCR Master Mix（A4004M，Lifeint生命互聯）。②miRNA cDNA Synthesis Kit逆轉錄試劑盒（CW2141S，CWBIO康為世紀）。③miRNA qPCR Assay Kit(CW2142S，CWBIO康為世紀）。④miRNA Purification Kit提取試劑盒（CW0627S，CWBIO康為世紀）。⑤Cell Cycle Staining Kit（CCS102，MULTI SCIENCES聯科生物）。⑥結晶紫染色液（G1061，Solarbio）。

1.3 方法

收集4種骨肉瘤細胞系，包括MG-63、U2OS、SaOS-2和SOSP-9607，引物由通用生物系統（安徽）有限公司合成。分別進行RNA提取、RNA濃度和純度測定、RNA逆轉錄，熒光定量PCR實驗測定細胞中的Circ_0104346的表達。選取Circ_0104346表達量最高的細胞系進行后續試驗。干擾骨肉瘤細胞中Circ_0104346的表達，流式檢測凋亡實驗檢測細胞凋亡情況，流式檢測周期實驗檢測細胞增殖情況。

1.3.1 細胞收集 用移液槍吸掉培養皿中的細胞培養液；在培養皿中加入Trizon裂解液，用移液槍吹打，將全部細胞懸液轉移到1.5 mL離心管中，-80℃保存。

1.3.2 RNA提取 向以上溶液中加入氯仿離心15 min后，試管液體分成3層，取無色水相層并將其轉移到新的1.5 mL RNase-Free離心管中，加入相同體積的乙醇（70%）并混勻并加入到收集管中，12 000 rpm離心半分鐘后棄流出液，加入700μl RW1 12 000 rpm離心半分鐘后棄流出液；加入500μl RW2 12 000 rpm離心半分鐘后棄流出液；加入35μl無RNase的水離心；得到的RNA保存在-80℃，防止降解。

1.3.3 測定RNA的濃度和純度 該研究中采用紫外分光光度儀（NP80，NanoPhotometer）分別在D260和OD280條件下進行數據檢測并進行實驗記錄、數據分析。具體方法是從上述1.3.2實驗步驟中保存的RNA液體中，吸取1.5 mL進行測定。

1.3.4 RNA逆轉錄 在準備好的RNase-free離心管中配制如下混合液（包括模板DNA、4×gDNA wiper Mix、RNase-free ddH2O），總容量16μl。在上述混合液中加入4μl的5×HiScript II qRT SuperMix II后混勻，加熱至50℃并保持該溫度15 min，后轉至85℃并保持5 s，產物用于qPCR反應。

1.3.5 流式檢測凋亡實驗 轉染成功后分組處理細胞，24 h后流式檢測各組細胞凋亡情況。

1.3.6 流式檢測周期實驗 轉染成功后分組處理細胞，24 h后流式檢測各組細胞周期情況。

1.4 統計方法

采用SPSS 20.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞中的Circ_0104346相對表達量情況比較

4組細胞間Circ_0104346相對表達量使用LSD法進一步對差異進行比較，可以看出其中SaOS-2＞MG-63＞SOSP-9607=U20S。表明SaOS-2細胞中Circ_0104346相對表達量最高，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 細胞中的Circ_0104346相對表達量比較

2.2 干擾Circ_0104346表達后各組細胞凋亡結果比較

3組細胞間的細胞凋亡可以看出干擾組＞空載組＞對照組。表明干擾Circ_0104346表達后，骨肉瘤細胞凋亡增加，增殖能力下降。差異有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 干擾Circ_0104346表達后各組細胞凋亡率比較

2.3 干擾Circ_0104346表達后各組細胞周期檢測結果比較

干擾組細胞處于G0/G1期數量明顯增多，處于S期細胞明顯減少，結果表明干擾Circ_0104346表達后，骨肉瘤細胞增殖及遷移能力明顯下降。

為了研究3組細胞間的細胞處于G0及G1期的細胞數是否有不同，使用LSD法進一步對差異進行比較，可以看出干擾組＞空載組＞對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表3。

表3 干擾Circ_0104346表達后各組細胞GO/GI數據比較

為了研究不同分組之間S有無差異，使用LSD法進一步對差異進行比較，可以看出對照組=空載組＞干擾組，使用單因素方差分析進行檢驗，結果顯示差異有統計學意義(P＜0.05)。見表4。

表4 干擾Circ_0104346表達后各組細胞S數據比較

3 討論

人骨肉瘤是兒童及青少年常見的骨原發性惡性腫瘤，合并轉移性疾病及耐藥的患者預后差，骨肉瘤耐藥機制及新的靶標尚不明確[7-8]。CircRNA是一種非編碼RNA，參與了生長發育、衰老、疾病等多種生命活動過程，具有調控基因表達的重要功能[9-10]。截至目前發現的CircRNA根據其來源可分為4類：外顯子來源的環狀RNA(CircRNA)、外顯子及內含子共同組成的環狀RNA(ElciRNA)、內含子來源的環狀RNA(ciRNA)和通讀環狀RNA(rt-CircRNA)[11]。其中CircRNA存在人體許多組織中，如肝臟、腎臟、心血管、牙周組織、周圍神經、腸道、子宮內膜中等發揮組織修復作用。隨著研究的不斷深入，人們總結出CircRNA具有以下生物學特征：CircRNA具有特殊的共價閉合環狀結構，因而具有高度的穩定性；CircRNA在真核生物中廣泛表達，截至到目前研究發現有超過20 000種的CircRNA,數量遠遠超過線型RNA；高度物種保守性，從目前發現CircRNA的生物學特性分析來看，多數具有高度保守的特性；從CircRNA分布來看，多數位于細胞質內，有些分布在細胞核內，因此其在細胞中的表達及分布存在特異性；CircRNA在不同系統的疾病或同一組織發育的不同階段表達的種類和數量也有不同，表現出組織特異性和發育階段特異性。CircRNA的生物學特征主要表現在：海綿吸附功能、調節基因轉錄、調節RNA結合蛋白、翻譯合成蛋白質、調控細胞間信號通路，通過這些生物學的特性在疾病的發生和發展的過程中起到極其重要的作用。

近年來，CircRNA在神經系統、心血管系統、呼吸系統等領域積累了一定數量的研究成果，另外研究還發現其在乳腺癌、肝癌、膠質瘤、肺癌、直腸癌等惡性腫瘤中也有異常的表達，CircRNA已經成為某些惡性腫瘤診斷指標和治療靶點。Zhu X等[12]通過對肺癌組織進行CircRNA測序發現，39個CircRNA的表達上調，20個CircRNA的表達下調。同樣但其在骨肉瘤中的作用仍有待進一步研究。

前期采用高通量CircRNA芯片技術檢測4例人骨肉瘤組織及對應癌旁組織中CircRNA表達譜，發現CircRNA在骨肉瘤組織中也同樣存在者特異性和差異性表達。其中Circ_0104346高表達，具體作用機制尚不明確。在利用骨肉瘤細胞進行相關的分子生物學實驗中，需要一種Circ_0104346表達含量高的骨肉瘤細胞系來進行細胞分子生物學的實驗[13]。

MG-63是一種常用的人骨肉瘤細胞，在其B細胞受體中，檢測出包括UVA活化蛋白激酶和絡氨酸激酶受體，表明MG-63可能有助于進行候選生物標志物治療及骨肉瘤的診斷研究，并可以為骨肉瘤的分子生物學機制研究提供合適的載體[14-15]；U-2OS是由Ponten J和Saksela E在1964年從1名15歲女性的脛骨中等分化的肉瘤中分離建立的[16]。該細胞能表達胰島素樣生長因子Ⅰ、Ⅱ（IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ）受體和骨肉瘤衍生生長因子（ODGF）；人成骨肉瘤細胞Saos-2是Fogh J和Trempe G分離和鑒定的眾多人類腫瘤細胞系中的一種，該細胞來自1名11歲的白人女性的骨肉瘤組織[17-18]；SOSP-9607組織來源于一名17歲男性患者，1996年7月16日因左脛骨上段成骨肉瘤行左大腿高位截肢術，截肢標本取材病理診斷成骨肉瘤(軟骨母細胞型)[19-20]。

該研究利用PCR對4種人骨肉瘤細胞系中的Circ_0104346進行檢測，結果顯示在上述四種細胞系中SaOS-2細胞系的Circ_0104346表達最高，和其他3種細胞比較差異有統計學意義（P＜0.05），因此該骨肉瘤細胞可以作為骨肉瘤耐藥機制的分子細胞學研究載體。

后續選擇SaOS-2細胞進行干擾實驗，干擾細胞中的Circ_0104346表達后，骨肉瘤細胞的凋亡率明顯增加，處于G0/G1細胞數量增多，處于S其細胞明顯減少，表明骨肉瘤細胞的遷移及侵襲能力明顯下降。

綜上所述，骨肉瘤細胞中Circ_0104346表達上調，干擾Circ_0104346的表達能抑制其細胞遷移及增殖能力。