四妙勇安湯對ApoE-/-小鼠主動脈粥樣硬化斑塊膠原和血管重構的影響

樊欽華，金 榮，杜雅薇，吳圣賢

動脈粥樣硬化為腦卒中、心絞痛等多種血管性疾病發生的基礎因素，本質是慢性炎癥性反應過程[1]，斑塊結構不穩定或破裂繼發栓塞嚴重者危及生命。四妙勇安湯是治療熱毒壅盛型脈管炎的經典名方，具有清熱活血的功效，近年來逐漸拓展用于診治心腦血管疾病。細胞外基質為斑塊纖維帽的主體結構組成，是影響斑塊結構穩定的關鍵部分，骨架以血管平滑肌細胞合成的膠原為主[2]。膠原表達直接決定纖維帽厚薄程度，其表達減少影響斑塊內部構成，導致斑塊纖維帽厚度減小。轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)具有抗炎、抑制脂肪條紋病變、防止動脈粥樣硬化發展、調節血管細胞功能的作用[3]，是細胞外基質，特別是Ⅰ型/Ⅲ型膠原合成的主要調節因子[4]。經過血管內皮損傷、小血管新生、纖維帽變薄、血管病理性重構等環節后破壞斑塊內部穩定結構，導致易破損斑塊形成。課題組前期研究顯示，四妙勇安湯治療動脈粥樣硬化療效確切[5-6]，可有效減輕血管炎癥反應，抑制動脈粥樣硬化進展，且安全性高[7]。本研究通過制載脂蛋白E(ApoE)-/-小鼠主動脈粥樣硬化動物模型，觀察四妙勇安湯對模型小鼠主動脈粥樣硬化斑塊膠原和血管重構的影響，進一步探討其對穩定斑塊的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級7～8周齡雄性ApoE-/-小鼠35只及同品系C57BL/6J小鼠10只，體質量20～25 g，購自北京大學醫學部實驗動物中心。實驗室室溫22～24 ℃，相對濕度50%，光照時間07：00～19：00。

1.2 實驗藥物 辛伐他汀(商品名舒降之，默沙東公司生產，批號：20080224)。四妙勇安湯免煎顆粒(含金銀花免煎顆粒、玄參免煎顆粒、當歸免煎顆粒、生甘草免煎顆粒，批號分別為：20081225、20090112、20090218、20081129)，由北京中醫藥大學東直門醫院提供。

1.3 實驗試劑及儀器 兔抗鼠平滑肌細胞α肌動蛋白(SMα-actin)，購自武漢博士德生物工程有限公司，批號：BA1025 ；二步法免疫組化檢測試劑(羊抗兔/鼠IgG抗體-HRP多聚體)，貨號：ZB1901，濃縮型DAB顯色試劑盒，均購自北京中衫生物技術有限公司；天狼星紅(Siriued)，美國Sigma公司產，貨號：G1360。旋轉式組織脫水機(型號4634)、組織包埋機(型號5235)、石蠟溶蠟箱(型號PM-401)、切片機(型號CRM-440)均系日本SAKURA產品；美國Image-Pro Plus Version 6.0 (IPP6.0)圖像分析軟件。光學顯微鏡Olympus(型號BX51)。

1.4 方法

1.4.1 造模及分組 高脂飼料喂養ApoE-/-小鼠制備動脈粥樣硬化模型。基礎飼料喂養ApoE-/-小鼠7～8周，之后改高脂飼料喂養13周后隨機處死5只，光鏡下觀察確認已形成基礎動脈粥樣硬化病變。其余30只ApoE-/-小鼠隨機分為模型組、辛伐他汀組和四妙勇安湯組，繼續高脂飼料喂養19周。以同品系C57BL/6J小鼠10只作為正常對照組，普通飲食飼養。

1.4.2 給藥方法 按成人與小鼠給藥劑量換算系數折算小鼠用藥量。辛伐他汀、四妙勇安湯組蒸餾水溶解灌胃。模型組和正常對照組按體重比例采用生理鹽水灌胃。各組小鼠每日給藥，連續19周。

1.5 觀察指標

1.5.1 取材 各組小鼠取材前夜禁食，次日按體重3.5%腹腔注射適量水合氯醛麻醉處死。無菌條件下取出心臟，4%多聚甲醛固定，脫水，常規石蠟包埋。每只小鼠主動脈根部取4個切面：升主動脈最近端橫截面、主動脈瓣起始橫截面、主動脈瓣附著部位并有冠狀動脈開口、主動脈瓣完全出現并有匯合傾向。切片厚5 μm，每隔100 μm連續取6張切片。

1.5.2 組織內膠原纖維類型及分布情況 采取天狼星紅-苦味酸染色。切片常規脫蠟至水；0.1%飽和苦味酸天狼星溶液染色2 h，流水沖洗10 min；蘇木素復染1～2 min，取出切片，流水沖洗10 min；最后脫水封片。光學顯微鏡采集圖像，40倍和200倍鏡下IPP 6.0圖像分析軟件測量各組小鼠主動斑塊內膠原含量。

1.5.3 主動脈根部斑塊內平滑肌細胞α肌動蛋白(SM-αactin)表達量 采取免疫組化二步法。SM-αactin一抗稀釋濃度為1∶100，每組取1張磷酸緩沖鹽溶液(PBS)進行陰性對照。切片脫蠟至水，加入3%的H2O2，經室溫孵育、PBS沖洗、微波修復，再滴加二抗(羊抗兔/鼠IgG抗體-HRP多聚體)，37 ℃培養箱孵育1 h，PBS沖洗3次，觀察DAB顯色。40倍和200倍鏡下采用IPP 6.0圖像分析軟計算陽性面積占斑塊面積比值，對斑塊內SM-αactin表達量進行分析。

1.5.4 主動脈根部斑塊內TGF-β1、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達量 選取第3切面，采用Envision免疫組化二步法。TGF-β1、VEGF的抗體稀釋度依次分別為1∶200與1∶200，每組均以PBS代替一抗作為陰性對照，每張切片分別選取左上、左下、下3個視野，100倍鏡下采用IPP 6.0圖像分析軟件對陽性表達區域累積面積進行測定，計算斑塊內各指標陽性區域面積占斑塊面積的百分比。

2 結 果

2.1 四妙勇安湯對ApoE-/-小鼠主動脈粥樣斑塊膠原面積的影響 正常對照組主動脈根部未形成斑塊，四妙勇安湯組斑塊內膠原面積增加，辛伐他汀組斑塊內膠原面積有一定程度增加。詳見圖1。與模型組比較，辛伐他汀組膠原面積增大，但差異無統計學意義(P>0.05)，而四妙勇安湯組斑塊內膠原面積增大明顯(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組小鼠主動脈粥樣斑塊膠原面積比較(±s) 單位：%

圖1 各組小鼠主動脈粥樣斑塊膠原面積天狼星紅-苦味酸染色圖(×40)

2.2 四妙勇安湯對ApoE-/-小鼠TGF-β1、VEGF表達陽性面積的影響 正常對照組主動脈根部無TGF-β1表達；與正常對照組比較，模型組斑塊局部TGF-β1表達明顯增加；與模型組比較，四妙勇安湯組TGF-β1表達明顯升高(P<0.05)。正常對照組主動脈根部無VEGF表達；與正常對照組比較，模型組斑塊局部VEGF表達升高。模型組與四妙勇安湯組VEGF表達陽性面積比較，差異無統計學意義(P>0.05)。詳見圖2、圖3、表2。

表2 各組小鼠TGF-β1、VEGF表達陽性面積比較(±s) 單位：%

圖2 各組小鼠主動脈根部斑塊內TGF-β1表達量免疫組化染色圖(×200)

圖3 各組小鼠主動脈根部斑塊內VEGF表達量免疫組化染色圖(×200)

2.3 四妙勇安湯對ApoE-/-小鼠主動脈根部粥樣斑塊SM-αactin陽性面積的影響 正常對照組主動脈根部未形成斑塊，動脈中膜無SM-αactin陽性表達顆粒，模型組和四妙勇安湯組小鼠動脈中膜和斑塊纖維帽處可見SM-αactin陽性表達顆粒。詳見圖4。與模型組比較，四妙勇安湯組和辛伐他汀組SM-αactin表達陽性面積差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 各組小鼠主動脈根部斑塊SM-αactin表達面積比較(±s) 單位：%

圖4 各組小鼠主動脈根部斑塊SM-αactin表達量免疫組化染色圖(×200)

2.4 四妙勇安湯對ApoE-/-小鼠血管重構的影響 與模型組比較，辛伐他汀組和四妙勇安湯組血管內彈力膜面積和血管腔面積均呈減小趨勢，但差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見表4。

表4 各組小鼠主動脈血管內外彈力膜面積和血管腔面積比較(±s) 單位：mm2

3 討 論

在血管內皮損傷、脂肪條紋病變、炎癥反應等多種因素相互作用下形成不穩定易破裂的動脈粥樣硬化斑塊，是諸多心腦血管系統病變急性發作的基礎，纖維帽變薄、脆弱與血管重構是主要的病理特點。血管炎癥反應在動脈粥樣硬化復雜的病理過程中發揮著重要作用，白細胞和血管平滑肌細胞之間的平衡是維持斑塊穩定的關鍵要素[8]。白細胞，尤其是巨噬細胞和T細胞聚集，是從正常血管壁結構向初期動脈粥樣硬化轉變的特征性標志[9]。炎癥反應辨證屬“熱毒”范圍，四妙勇安湯以金銀花為君，并佐以玄參、當歸、生甘草，促進血液循環同時可有效改善超敏C反應蛋白、腫瘤壞死因子α、白細胞介素-1、白細胞介素-6等炎癥介質，具有較好的抗炎作用。

在病變血管中，以Ⅰ型TGF-β表達為主，TGF-β1可大量增加于細胞外基質。動脈粥樣硬化病變過程中，脂肪刺激血管平滑肌細胞肥大、去分化，并增殖遷移至內膜，導致血管壁肥厚。模型組小鼠表現的低含量TGF-β1可能導致血管壁中白細胞聚集。TGF-β在體內具有一系列協同保護效應[3]，這種保護作用喪失可增加脂質病變沉積，導致穩定的富含細胞外基質的斑塊表型轉變為有破裂風險的不穩定的促炎斑塊[10]。斑塊內白細胞聚集增加，加之其余血管平滑肌細胞產生的細胞外基質減少，增加斑塊破裂風險。TGF-β1通過下游信號Smad3可抑制基質金屬蛋白酶表達，進而阻止細胞外基質降解[11]。核轉錄因子-κB是通過核轉錄因子κB抑制因子A(IκBα)的磷酸化被激活，再經絲裂原活化蛋白激酶刺激從而調節TGF-β/Smad信號轉導[12]。課題組前期實驗研究表明，四妙勇安湯可降低核轉錄因子-κB，增高核轉錄因子κB抑制因子A(IκBα)表達，還可抑制基質金屬蛋白酶-9，降低模型小鼠總膽固醇、三酰甘油水平[6，13-14]。本研究結果顯示，四妙勇安湯組斑塊局部TGF-β1與膠原表達增加，進一步證實了四妙勇安湯是通過增加TGF-β1，抑制炎性細胞聚集，防止脂質損傷，并調控核轉錄因子-κB/IκBα/基質金屬蛋白酶-9表達，引起纖維帽血管平滑肌細胞產生細胞外基質，抑制膠原分解，促進血管纖維化，進而維持正常的血管壁結構，穩定斑塊。VEGF雖未見顯著差異，相較于模型組高VEGF表達情況，說明四妙勇安湯具有減少VEGF趨勢，提示四妙勇安湯可一定程度保護血管內皮細胞，抑制斑塊內血管新生。

血管病理性重構是動脈粥樣硬化的晚期特征，內外因素長期作用下刺激血管平滑肌細胞遷移，基質金屬蛋白酶降解膠原纖維，細胞外基質代謝失衡重組，導致血管適應性動態重塑[15]，主要表現為管壁增生肥厚、血管彈力下降等管壁厚度、管徑及血管形狀改變，增加斑塊破裂風險。血管病理性重構，具備中醫“瘀血”特征。四妙勇安湯作為活血解毒代表方劑，《黃帝內經》記載：“疏其血氣，令其調達”，概括了四妙勇安湯抗凝、改善血液循環、抗氧化、抑制血栓形成的功效。本研究中血管內外彈力膜面積與血管腔面積雖未表現出顯著差異，但均明顯縮小，作用強度與辛伐他汀相近，提示四妙勇安湯可一定程度上改善管腔狹窄，穩定血管結構，抑制血管重構。

破潰斑塊屬于動脈粥樣硬化病變過程的“痰核毒化期”，此階段的病機特點是熱毒瘀血互結致損[16]，動脈粥樣硬化與脈管炎皆是血管性病變，破潰斑塊與熱毒壅盛型脈管炎病機相近，與四妙勇安湯清熱解毒活血的功效、方義相符。本研究結果顯示，四妙勇安湯主要通過增加TGF-β1表達從而增加斑塊內膠原含量。TGF-β受體的表達模式對已發生的血管壁改變具有鎖定作用，即使TGF-β活動恢復正常，已分化的內膜血管平滑肌細胞通過產生細胞外基質而不是恢復至收縮狀態來反映，因而，高含量TGF-β1表達可形成穩定的富含基質的動脈粥樣硬化斑塊[3]。

四妙勇安湯可抑制血管內彈力膜面積與血管腔面積增厚，防止病理性重構，有利于穩定血管結構。四妙勇安湯應用于改善動脈粥樣硬化打破了傳統觀念認為其是脈管炎專方的看法，通過觀察四妙勇安湯對斑塊膠原和血管重構的影響，為臨床治療動脈粥樣硬化、穩定動脈斑塊進一步提供了動物實驗依據，以期拓寬臨床的治療思路。