癌性爆發痛小鼠模型的優化與評價

楊 慧，李 欣，劉 靜，黃 東，顏 輝

(1.中南大學湘雅三醫院麻醉科，湖南 長沙 410013；2.中南大學湘雅二醫院疼痛科，湖南 長沙 410012；3.湖南省兒童醫院麻醉科，湖南 長沙 410007；4.中南大學湘雅三醫院疼痛科，湖南 長沙 410013；5.中南大學湘雅三醫院神經外科，湖南 長沙 410013)

癌性爆發痛是臨床上一類難治性癌痛，發生率高達40%～80%[1-2]，是導致癌痛治療效果不佳的重要原因[3]。目前國內外關于癌性爆發痛的研究多集中于臨床特征和藥物應用方面[4]，對動物模型的研究罕見報道，因此建立穩定的癌性爆發痛模型已成為亟須解決的關鍵問題。本實驗在前期成功制備內皮素-1(ET-1)單次誘發型骨轉移癌性爆發痛動物模型的基礎上(PMID：26828300)，改進嗎啡和ET-1注射的次數和天數，制備4組模型小鼠，通過比較行為表現和痛閾變化，選出優化的癌性爆發痛模型，并從疼痛行為學角度對該模型進行評價，以期為進一步研究提供可靠的模型平臺。

1 材料與方法

1.1實驗動物 6～8周齡雄性C57BL/6小鼠54只，體重20～25 g，購買于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。每4～5只小鼠放一個鼠籠，飼養于光控(8：00—20：00，12 h照明)和溫控[(22.0±0.5)℃]、相對濕度為50%的房間內自由獲取水和食物。本研究獲得中南大學湘雅三醫院動物倫理委員會的批準[No.LLSC(LA) 2016-017]。

1.2儀器及試劑 離心機(Centrifuge 5804R、5415R型，德國Eppendorf公司)，CO2細胞培養箱(美國Thermo公司)，恒溫水浴箱(瑞典Pharmacia公司)，全自動制冰機(美國Labrepco 公司)，玻璃觀察箱(50 cm×20 cm×30 cm，自制)，Von Frey纖維絲測痛儀(美國North Coast Medical公司)，計時器(上海市秒表廠)。一次性細胞培養瓶(25 cm2/75 cm2，美國AXYGEN公司)，一次性離心管(15 mL/50 mL，美國AXYGEN公司)，全自動細胞計數器(美國Bio-Rad公司)，微量進樣器(10 μL/25 μL，上海市高鴿工貿有限公司)。高糖培養基(美國Gibco公司)，胎牛血清(美國Gibco公司)，HBSS液(美國Gibco公司)，0.25%胰酶細胞消化液(美國Gibco公司)，戊巴比妥鈉鹽(德國Merck公司)，氯四環素軟膏(江蘇南京白敬宇制藥有限公司)，鹽酸嗎啡注射液(10 mg/1 mL，181102-2，東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司，以生理鹽水稀釋，濃度為0.5 mg/mL)，ET-1[1 mg，E7764，美國Sigma公司，以無菌去離子蒸餾水溶解，濃度為75 μg/mL(30 pmol/μL)]。

1.3模型建立

1.3.1Lewis肺癌細胞懸液的制備 小鼠Lewis肺癌細胞株由中南大學湘雅醫學院細胞庫提供，用含1%雙抗生素和10%胎牛血清的高糖培養基培養，放于充滿5%CO2的37 ℃細胞培養箱中，隔天傳代。經0.25%胰酶消化液消化后，取10 mL，1 000 r/min離心，沉淀5 min，沉淀物用HBSS液重懸，TC10TM自動細胞計數器計數細胞。用HBSS稀釋細胞以達到每微升2×105個細胞的最終濃度，并保存在冰盒上備用。

1.3.2骨癌痛模型的建立 參照以往課題組方法[5]：將Lewis細胞混勻，用25 μL微量進樣器吸取細胞混懸液10 μL(2×106個細胞)待用。2%戊巴比妥鈉溶液(50 mg/kg)腹腔注射，麻醉小鼠。將小鼠左后肢固定，剪毛、消毒膝關節處皮膚。在膝關節處沿股直肌肌腱方向切開一小段皮膚切口，暴露白色肌腱。鈍性分離肌腱，暴露髁間窩伸面。用1 mL無菌注射器針頭按股骨長軸方向，從近髁間窩頂端鉆孔，有明顯落空感則已進入股骨骨髓腔。換用25 μL微量進樣器，向骨髓腔內緩慢接種Lewis細胞10 μL。留針20 s后退出針頭，醫用無菌骨蠟封閉針孔?？p合皮膚后，抹上氯四環素軟膏。待活動恢復，將小鼠放回籠中。

1.3.3ET-1單次誘發型癌性爆發痛模型的建立 骨癌痛模型建立后的第16天，小鼠腹腔注射嗎啡溶液6 mg/kg，30 min達到良好鎮痛后，股骨腫瘤內注射ET-1溶液20 μL(150 pmol)。

1.4實驗分組 取36只C57BL/6小鼠，隨機分為4組：一次組(QD組)、兩次組(BID組)、三次組(TID組)和四次組(QID組)，每組9只。各組在骨癌痛模型建立后第16天開始至第18天，連續3 d，每天嗎啡和ET-1注射次數分別為1次(注射時間點為每天08:00)、2次(注射時間點為每天08:00、20:00)、3次(注射時間點為每天08:00、14:00、20:00)、4次(注射時間點為每天08:00、12：00、16:00、20:00)，注射部位和劑量同前。在每次嗎啡注射前，觀測各組小鼠表現和疼痛行為學指標。

另取18只C57BL/6小鼠，根據上述結果確定其中一組為優化模型后，復制該模型(n=9)，從第16天開始連續3 d，在每天08:00嗎啡處理前對小鼠進行一般情況觀察。并根據前期實驗時間點，選擇在每次嗎啡注射前第0分鐘、嗎啡注射后30 min(ET-1注射前)、嗎啡注射后40 min(ET-1注射后10 min)和嗎啡注射后60 min(ET-1注射后30 min)時，觀察小鼠行為表現和檢測兩項疼痛行為學指標，并以單次誘發型癌性爆發痛模型小鼠為對照(n=9)，對該優化模型進行評價。

1.5疼痛行為學測試

1.5.1機械縮足閾值(PWMT)測定 采用“up-down”的方法[6]，將小鼠置于距臺面40 cm的底部為金屬網的觀察箱中適應20 min，依次用Von Frey纖維絲(0.16、0.40、0.60、1.00、1.40 g和2.00 g)的尖端刺激小鼠的左足底中部足墊。每次刺激3～4 s，陽性反應是當纖維絲尖端持續增大壓力至稍彎曲呈近似S形時，小鼠快速抬起測試后肢。每種引出陽性反應的纖維絲在每只動物后肢上測試6次，間隔時間為2 min。小鼠該側后肢的機械觸痛閾值界定為能引出3次或3次以上陽性反應的最小纖維絲值。

1.5.2后足使用評分測定 測試前小鼠在透明的有機玻璃觀察箱中適應20 min，然后再進行觀察。后足使用評分標準[7]：0分為完全不使用左后足；1分為偶爾使用左后足；2分為左后足明顯跛行，患肢輕度抬高；3分為左后足輕度跛行；4 分為正常行走。每次觀察4 min，統計各組小鼠在這4 min內的后足使用評分，但其正常行走、整理毛發或晚期腫瘤致足部懸空等時的抬足行為則不予計算在內[8]。間隔5 min后，重復測試1次，結果取兩次平均值計算小鼠患側4 min內的后足使用評分。

2 結 果

2.1各組模型小鼠的疼痛行為學改變

2.1.1行為觀察 各組小鼠每天注射不同次數的嗎啡和ET-1，隨著嗎啡注射次數的增多，QID、TID組和BID組小鼠均先后出現不同程度嗎啡過量的表現，即小鼠不停走動或跳躍，活動增多、速度增快，出現易被激惹、豎尾等興奮狀態。而QD組3 d內均顯示良好的嗎啡鎮痛，表現為小鼠活動增加，左后肢使用增多，無豎尾現象出現。

2.1.2各組藥物注射前后PWMT比較 藥物注射第1天時QD、BID組和TID組各時間點PWMT數值無顯著差異，而QID組在藥物第4次注射前，其PWMT較前明顯升高(P<0.05)，見圖1A。藥物注射第2天時，QD組和BID組各時間點PWMT數值無顯著差異，TID組在藥物第3次注射前PWMT較前顯著升高(P<0.05)，而QID組的PWMT則一直維持較高水平。第3天時，QD組的PWMT較前稍下降，而BID組第1次給藥前數值稍升高，第2次給藥前則開始明顯升高(P<0.05)，TID組的PWMT隨著注射次數增多逐漸升高，而QID組較第2天時稍下降但仍維持在較高水平。

2.1.3各組小鼠相同時間點后足使用評分比較 藥物注射第1天時各組小鼠后足使用評分差異均無統計學意義(P>0.05)。但藥物注射第2天開始，TID組和QID組后足使用評分先后明顯升高(P<0.05)，見圖1B，但QD組和BID組仍無明顯改變。而第3天時，QD組后足使用評分明顯下降，BID組則稍升高，TID組和QID組較第2天稍下降，但仍維持在較高水平。

A.左后肢的PWMT；B.后足使用評分。1-1st、1-2nd、1-3rd和1-4th分別為第1天第1次、第2次、第3次和第4次嗎啡和ET-1注射時間點，以此類推(n=9)。a、b、c表示與每組初始值相比，P<0.05。

2.1.4小鼠的疼痛行為學表現與人類癌性爆發痛臨床表現的符合情況 盡管ET-1腫瘤內注射可使疼痛閾值下降，但嗎啡的重復注射可導致小鼠左后足長時間的痛閾異常升高。隨著嗎啡和ET-1每天注射次數的增加，小鼠的PWMT會較長時間維持在高水平，后足使用評分亦會升高，注射次數越多，痛閾升高越早。因此，QID組、TID組和BID組小鼠的疼痛行為學表現均與人類癌性爆發痛臨床表現不符，QD組符合人類癌性爆發痛臨床表現。

2.2癌性爆發痛小鼠優化模型的疼痛行為學評價 選用QD組小鼠為癌性爆發痛優化模型，并觀測該優化模型在整個實驗過程中的疼痛行為學變化。藥物連續注射3 d中，在嗎啡注射后30 min即ET-1腫瘤內注射前，癌性爆發痛優化模型小鼠的PWMT和后足使用評分均較嗎啡注射前顯著升高(P<0.05)，見圖2。而在ET-1注射后的30 min內，在第10分鐘(嗎啡注射后第40分鐘)時兩項指標均迅速下降，較ET-1注射前(嗎啡注射后第30分鐘)顯著降低(P<0.05)；而在ET-1注射后第30分鐘(嗎啡注射后第60分鐘)時，兩項疼痛行為學指標較第10分鐘(嗎啡注射后第40分鐘)時的相應指標均升高(P<0.05)。癌性爆發痛小鼠優化模型在3 d內每天的兩項疼痛行為學指標在注射嗎啡和ET-1的前后變化與單次癌性爆發痛模型均相似，符合臨床癌性爆發痛的發作特點，即此癌性爆發痛小鼠優化模型建立成功。

每天嗎啡腹腔注射前對優化模型小鼠左后肢的疼痛行為學指標進行檢測以判定其痛閾改變，結果表示ET-1注射的3 d內，其兩項疼痛行為學指標均呈現下降趨勢，但其中PWMT 3 d內(1-0 min、2-0 min、3-0 min)差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2A；而后足使用評分第3天(3-0 min)與第1天(1-0 min)相比明顯下降(P<0.05)，見圖2B。說明QD組連續3 d每天腹腔注射嗎啡1次并沒有影響到痛閾升高，而每天腫瘤內注射1次ET-1卻能降低痛閾，發揮了其連續誘發癌性爆發痛的作用。

A.左后肢的PWMT；B.后足使用評分。1-0 min、1-30 min、1-40 min和1-60 min分別為第1天嗎啡注射前第0分鐘、嗎啡注射后第30分鐘(ET-1注射前)、嗎啡注射后第40分鐘(ET-1注射后第10分鐘)和嗎啡注射后第60分鐘(ET-1注射后第30分鐘)注射時間點，以此類推(n=9)。與同一天前一時間點數值相比，aP<0.05；與第1天同一時間點數值相比，bP<0.05。

3 討 論

癌性爆發痛是一種在基礎疼痛得到穩定和充分控制的情況下，由自發或誘發因素導致的突發的、短暫的劇烈疼痛[9-10]，主要臨床特征為發作迅速(3 min之內達峰值)，疼痛劇烈(NRS評分≥7分)，持續時間短(幾秒至30 min之內)，24 h內多次發作(平均每天4～6次)[11-12]。本課題組在前期成功制備了小鼠骨癌痛模型(PMID：18326905)基礎之上，用外源性ET-1注射至骨癌痛小鼠股骨腫瘤內，模擬臨床上癌痛患者局部高濃度ET-1刺激[13-14]，成功制備了ET-1單次誘發型癌性爆發痛小鼠模型(PMID：26828300)。

由于臨床上癌性爆發痛的發作特點為24 h內多次發作，且極少存在單次發作或只發作1 d的情況，因此有必要將造模條件優化，篩選出合適的藥物注射天數和次數，使模型更接近人類癌性爆發痛臨床特點。課題組的前期研究發現，小鼠左后肢股骨接種Lewis細胞后，腫瘤隨時間不斷增大，造模第16天，瘤體大小可達2 cm×1 cm×1 cm，達到肉眼注射條件；第19天開始有部分小鼠會出現行動遲緩、活動減少，患肢外翻畸形甚至骨折、神經損傷等情況，另有部分小鼠開始有自發性爆發痛的發生，不利于癌性爆發痛行為學研究，故本實驗中所有小鼠注射藥物的時間均選擇從骨癌痛模型建立后第16～18天。

每次嗎啡注射前，課題組均會觀察4組模型小鼠的一般表現并行疼痛行為學測試。隨著嗎啡注射次數的增多，QID、TID組和BID組均在3 d內先后出現不同程度的嗎啡過量表現。而QD組主要表現為小鼠活動增加，左后肢使用增多，無豎尾反應出現。另外，從疼痛行為學結果中還可以看出，左后肢的PWMT和后足使用評分具體變化雖不盡相同，但趨勢基本一致，QID組、TID組和BID組先后出現痛閾明顯增高的現象。盡管本實驗設計初衷盡可能地想模擬臨床上癌性爆發痛每天平均4次的發作頻率，但在藥物注射的3 d內，嗎啡每天注射次數增加所帶來的鎮痛效應掩蓋了ET-1每天注射次數增加所產生的痛敏效應，只有QD組每次處理前的疼痛行為學測試結果符合癌性爆發痛發作表現，故選用QD組為癌性爆發痛優化模型。

再次成功復制該QD組模型后，每次藥物注射前后，通過對小鼠進行左后肢的PWMT和后足使用評分檢測，觀察其誘發痛和自發痛的痛閾變化，發現兩者均表現出相同的變化趨勢，即在嗎啡注射前兩者均處于較低值，而在腹腔注射嗎啡后30 min時，其痛閾均較前明顯升高，接近于正常水平。小鼠痛閾大幅度升高，證明該劑量嗎啡可使骨癌痛小鼠達到良好鎮痛。但在ET-1注射后10 min左右，小鼠的痛閾均明顯降低，并且前期實驗在ET-1注射后30 min內各組分別行患側坐骨神經電生理檢測，證明爆發痛是在嗎啡鎮痛良好的基礎上突然發生的疼痛(PMID：26828300)。ET-1瘤體內注射可以使小鼠表現出短暫劇烈的爆發痛行為，主要表現為小鼠失去活動意愿，活動性下降，并出現連續的自發抬足行為，不愿使用患肢，偶出現患肢的抽搐現象。ET-1注射30 min后，小鼠痛閾逐漸回升，持續到觀察期結束。在3 d的連續觀察中，每天藥物注射前后的小鼠表現和疼痛行為學指標均類似，癌性爆發痛發生較快(5 min之內)，但疼痛持續時間較短(30 min之內)，以10 min為分界點痛閾呈現先降后升的趨勢，與臨床上癌性爆發痛患者的表現高度相似[15-16]，說明該癌性爆發痛優化模型制備成功且可靠。

本研究通過模擬腫瘤內的高水平ET-1刺激誘發癌性爆發痛，觀察測試了小鼠癌性爆發痛發作時劇烈的疼痛行為學表現。通過實驗確定嗎啡和ET-1注射天數為3 d和每天注射次數為1次后，成功建立了與臨床患者表現相似的ET-1誘發型癌性爆發痛優化模型，為后續癌性爆發痛的進一步研究提供了穩定可靠的模型平臺。