BDNF基因甲基化水平及Val66Met基因多態性與腦卒中后焦慮的關系

沙娟娟，翟潔敏，鄭莉莉，何劍波

急性腦卒中病人的日常生活能力常受到嚴重影響，約30%的腦卒中病人常伴隨明顯的精神癥狀，研究發現，24%的腦卒中病人出現腦卒中后焦慮(post-stroke anxiety，PSA)，且焦慮癥狀可持續2～5年，導致病情恢復緩慢，致殘率增加，嚴重影響病人的生活質量[1-3]。因此，有效地診斷和管理PSA顯得尤為重要。以往的研究主要集中在社會人口學和發病前腦卒中相關因素的分析，有關PSA的生物學機制尚不明確[1，4]。研究表明，腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)參與了腦卒中后神經元的可塑和神經的發生，并抑制細胞凋亡，可能是發生PSA潛在的生物學機制，且BDNF表達的減少與壓力的易感性增強有關，使焦慮的患病率明顯增加[1，5]。研究表明，海馬區神經元BDNF的廣泛表達及其在突觸的長時程記憶中的作用與焦慮的生物學機制密切相關[1]。同時，BDNF的表達受表觀遺傳基因的調控，在核苷酸196 G/A處具有功能性單核苷酸多態性(SNP)，即66位點處纈氨酸被蛋氨酸替代(Val66Met)，與普通人群相比，SNP在腦卒中病人中更易出現焦慮癥狀[6-7]。此外，BDNF基因中DNA甲基化還受環境應激因素的影響，通過增加CpG甲基化水平，減少BDNF基因的表達[1]。腦卒中后抑郁(PSD)與BDNF相關性研究較多，但有關BDNF甲基化水平及Val66Met基因多態性與急性期和慢性期PSA易感性的相關性動態前瞻性研究較少。本研究擬探討腦卒中2周和1年后BDNF甲基化水平和BDNF Val66Met 基因多態性與PSA易感性的關系及其相互作用，為早期識別高風險的PSA病人提供臨床依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2016年1月—2018年9月在西電集團醫院神經內科住院的急性腦卒中病人268例，隨訪觀察1年，拒絕隨訪和失訪病人60例，納入208例病人，2周后和1年后根據醫院焦慮抑郁量表(HADS)將其分為腦卒中2周后病人隊列(PSA病人25例，非PSA病人243例)和腦卒中1年后病人隊列(PSA病人33例，非PSA病人175例)，診斷標準依據《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》[8]。所有入選病人均接受抗血小板聚集、降脂、穩定斑塊、護腦、改善循環、營養神經、減輕水腫等基礎治療。收集所有病人腦卒中后2周和1年后的基線資料，包括年齡、性別、受教育年限、既往史(抑郁史、腦卒中史、高血壓、糖尿病、心臟病、高膽固醇血癥)、體質指數(BMI)、腦卒中部位。本研究獲得西電集團醫院倫理委員會批準，入選者均自愿簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準 納入標準：①腦磁共振成像(MRI)診斷為缺血性腦卒中者；②能夠獨立完成全部調查和問卷者。排除標準：①嚴重威脅生命或影響腦卒中康復的疾病，如大面積腦梗死或腦出血等；②言語困難、構音障礙等交流障礙者；③其他神經、精神合并癥包括癡呆、帕金森病、腦瘤、癲癇、精神病和/或酒精和物質依賴性精神病者；④簡易精神狀態評價量表(MMSE)<16分者。

1.3 焦慮抑郁及神經功能評分測定 采用醫院焦慮抑郁量表(Hospital Anxiety and Depression Scale，HADS)對腦卒中后2周及1年后病人的焦慮癥狀進行測評。由兩名經驗豐富的主治及以上醫生進行評分，取算術平均值為最終得分，此量表是包括針對焦慮(HADS-A)和抑郁(HACS-D)癥狀的2個亞量表，各7個問題，本研究主要進行HADS-A評分，11～21分為確定存在焦慮癥狀，7～10分為可疑焦慮，<7分為無焦慮癥狀，即≥7分可確診為PSA病人[1，9]。神經功能缺損程度采用美國國立衛生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS)評定，分值為 0～45分，神經功能缺損程度越嚴重分值越高。抑郁狀態應用漢密爾頓抑郁量表(Hamilton Depression Scale，HAMD)進行評估，≥8分可診斷為PSD。

1.4 BDNF基因甲基化、Val66Met基因多態性分析 采集靜脈血，提取DNA，使用亞硫酸氫鹽測序法(bisulfite sequencing PCR，BSP)檢測BDNF基因啟動子區甲基化水平，嚴格按照甲基化試劑盒操作(QIAGEN公司生產)，包括7個CpG位點、BDNF基因啟動子CpG島序列。參考UCSC網站(http://genome.ucsc.edu/)，設計相應甲基化引物，通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增目的片段，跑膠進行膠回收PCR產物測序，分析CpG位點甲基化水平，基于限制性片段長度多態性-聚合酶鏈式反應(restriction fragment length polymorphism-polymerase chain reaction，RFLP-PCR)對BDNF基因上的SNP Val66Met進行基因分型(val/val、val/met及met/met)。

2 結 果

2.1 兩組一般資料比較 腦卒中后2周和1年均診斷為PSA病人6例，腦卒中后1年PSA患病率(15.9%)較腦卒中后2周PSA患病率(9.3%)明顯升高(χ2=4.677，P=0.031)。腦卒中后2周時，與非PSA病人比較，PSA病人年齡較小，女性、抑郁史、PSD、前循環腦卒中部位占比明顯增加，后循環腦卒中部位占比明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。腦卒中后1年，與非PSA病人比較，PSA病人女性占比、NIHSS評分、PSD占比、高血壓史占比明顯增加，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組BDNF基因甲基化水平和Val66Met多態性基因型比較 腦卒中后2周，與非PSA病人比較，PSA病人Val66Met基因多態性met/met基因型占比明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；腦卒中后1年，與非PSA病人比較，PSA病人CpG2、CpG9位點及平均CpG 甲基化水平明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 兩組BDNF基因甲基化水平和Val66Met多態性基因型比較

2.3 BDNF基因甲基化水平、Val66Met基因多態性對PSA的影響 將年齡、性別、抑郁史、NIHSS評分、PSD、前循環腦卒中、后循環腦卒中、高血壓史、各CpG位點、CpG平均甲基化水平及Val66Met基因多態性等變量納入單因素Logistic回歸分析，各因素經協變量調整后，PSD、后循環腦卒中是腦卒中后2周PSA發生的影響因素(P<0.05)，性別(女性)、PSD、高血壓是腦卒中后1年PSA發生的影響因素(P<0.05)。詳見表3。

表3 腦卒中后2周和1年PSA影響因素的Logistic回歸分析

2.4 BDNF基因甲基化水平及Val66Met基因多態性對PSA易感性的多因素Logistic回歸分析 腦卒中后2周，PSA病人易感性與Val66Met基因多態性中met/met基因型有關(P<0.05)；腦卒中后1年，PSA易感性與BDNF啟動子區域CpG2、CpG9位點及平均CpG甲基化水平有關(P<0.05)；在相乘作用模型中，腦卒中后2周 BDNF平均甲基化水平與Val66Met基因多態性的交互作用對PSA的易感性有關(P<0.05)。詳見表4。

表4 BDNF基因甲基化水平及Val66Met基因多態性對PSA易感性的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

PSA是一種多因素影響的疾病，主要受生物學和表觀遺傳基因調控，其中BDNF基因表達的高低與PSA易感性有關[1]。既往研究表明，DNA甲基化水平調控BDNF基因的表達，高甲基化狀態與BDNF基因的低表達密切相關[10]。BDNF是各種神經元發育和生存所必需的營養物質，在神經突觸可塑性和長時程記憶中發揮著重要作用，參與焦慮癥發生的病理生理學機制[1]。本研究通過建立腦卒中隊列，探討BDNF基因甲基化水平、Val66Met基因多態性及其相互作用與焦慮發生的關系，結果顯示，腦卒中后2周病人(急性期)中PSD、后循環腦卒中、BDNF Val66Met基因多態性中met/met基因型的腦卒中病人更易患PSA；腦卒中后1年的PSA病人(慢性期)患病率明顯升高，女性、PSD、高血壓、BDNF基因CpG2、CpG9位點及平均CpG甲基化高水平病人更易患PSA。

大量動物模型和群體隊列研究表明，BDNF基因中高甲基化水平與焦慮發生有關[1，11-12]。本研究結果顯示，BDNF基因的高甲基化水平與PSA發生率有關。雖然本研究未檢測BDNF基因的表達量，但以往研究證實，PSA病人存在較低的BDNF基因表達水平，BDNF水平的降低可能會干擾腦卒中病人的杏仁核和海馬區對恐懼情緒的處理，使腦卒中病人長期處于高度緊張狀態，逐漸出現腦卒中后焦慮癥狀[3，10]。情緒穩定劑和心理治療方法在內的干預治療有助于降低BDNF的高甲基化水平，且治療前甲基化狀態越高，治療效果越好[1]。在本研究中，腦卒中后1年的PSA病人BDNF基因存在較高的甲基化水平，而BDNF Val66Met基因多態性中met/met基因型與腦卒中后2周的PSA的發生有關，腦卒中后1年PSA發生的風險與BDNF甲基化水平變化有關，而與BDNF基因多態性無關。影響焦慮的機制有：①慢性壓力(殘疾、失業、經濟壓力等)可引起腦循環糖皮質激素水平升高，干擾BDNF基因的表達，加劇焦慮的發生，BDNF甲基化水平可能僅在腦卒中后1年對焦慮的發展起直接作用，如BDNF基因甲基化水平與海馬回結構神經環路相關，此部位主要參與焦慮形成相關的恐懼情緒的調節以及記憶鞏固、恢復調節的重要部位，主要參與應激反應情緒的調節與BDNF mRNA水平的調節[1，14-15]；②在腦卒中急性期(2周內)，生物因素的變化導致腦卒中病人產生代償性或適應性應激反應，BDNF的變化可能增加PSA的風險。已有研究表明，Val66Met基因多態性對焦慮的發生具有易感性，目前的研究表明，BDNF基因多態性在腦卒中病人慢性期的焦慮癥狀中并不具有相關性，但腦卒中后2周PSA的發生可能與BDNF高甲基化水平及Val66Met基因多態性中met/met基因型的共同作用有關，兩者都降低BDNF基因的表達，未來仍需要進一步擴大腦卒中樣本來研究BDNF基因甲基化水平及Val66Met基因多態性與焦慮發生的關系[16]。

本研究通過對BDNF基因甲基化水平及Val66Met基因多態性與PSA易感性的研究發現，BDNF基因甲基化水平改變可作為PSA發生的易感性潛在生物標志物，應密切監測BDNF基因平均甲基化水平較高的腦卒中病人，以確定焦慮的發生情況，特別是在腦卒中后的慢性期。而在腦卒中的急性期中，具有Val66Met基因多態性中met/met基因型的病人也應密切關注其焦慮的發生情況。由于目前BDNF甲基化水平與Val66Met基因多態性檢測相結合是相對無創的，且隨著時間的推移，這些值的變化在生物學上是穩定的，通過簡單的實驗室指標檢測有助于確定腦卒中病人PSA發生的風險。此外，藥物治療如使用DNA甲基化抑制劑可以逆轉甲基化水平，具有明顯的抗焦慮作用，有助于開發針對PSA治療的新靶點藥物。