高核糖核酸酵母選育的研究進展

陳皓，付雪蓉，鈕成拓，鄭飛云，劉春鳳，李崎，王金晶 *

(1.工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫 214122;2.江南大學 釀酒科學與工程研究室，江蘇 無錫 214122)

RNA是生命的重要組成部分之一，普遍存在于所有生命體中，與生物合成蛋白質有著緊密的聯系[1]。核酸及其衍生物可以開發二代味精、醬油等新型食品調味品；用作水稻、瓜果等農作物的生長促進物質；用作制造治療冠心病、腫瘤、心肌梗塞等疾病的藥物等，其工業化生產就顯得意義非凡。

目前生產RNA應用最多的是酵母菌，其RNA含量最高可達到菌體干重的14%～15%，且易于培養。并且釀酒酵母是一種公認的安全(GRAS)微生物，是RNA的首選工業來源。日本是最早開始研究利用酵母來生產RNA的國家，自20世紀60年代開始，通過不斷改進酵母發酵生產RNA的工藝，實現了相當成熟的技術應用[2]。目前，RNA的各項功能與應用擴展已經引起重視，RNA的高效分離提取對酵母選育工作效率的提升也有著促進作用，富含核糖核酸的酵母選育研究在酵母生產RNA領域中具有十分重要的意義，也逐漸成為研究的主要方向之一。

1 酵母RNA的功能及應用

酵母RNA不僅在基因表達和蛋白質生物合成方面起著決定性作用，而且具有風味功能以及促進其他生命體細胞生命活動等諸多生理功能和相關應用，見圖1。隨著科學技術的快速發展，科研工作者已經闡明其在生物體內的一些作用機理，它在食品、醫藥、保健、農業等行業具有十分廣泛的應用前景，未來利用酵母RNA時也將更加具有針對性和開闊性。

圖1 酵母RNA的功能及應用[3]

1.1 風味功能與應用

酵母抽提物是一種天然的調味品，帶有濃郁的肉香味和酵母特有的香味，既可為食品增香，又可掩蓋食物的異味，同時還具有減鹽、緩酸、除苦的效果。其中酵母RNA在鮮味增強作用中占主導，主要體現在呈味核苷酸——鳥苷酸(IMP)和肌苷酸(GMP)上，IMP呈鮮菇味，GMP呈雞肉鮮味。研究表明IMP和GMP的呈味作用取決于其化學結構，只有核苷5′-位上的-OH與磷酸基團發生酯化才表現出鮮味活性，而2′-和3′-位上的-OH磷酸酯化無鮮味[4]。

在食品領域中，酵母RNA利用其獨特的風味功能可以用作醬油等調料，在肉類加工、魚類加工、罐頭等生產工序上還可以用作鮮味增強劑以及風味掩蓋劑。例如，以一定比例同時添加IMP及GMP不僅能增強產品的甜、鮮等風味，而且能改善產品的口感[5]；在方便面調料中，將酵母抽提物與其他調料配合使用，香味將更加濃郁[6]；在醬油、調味醬汁中添加IMP等此類核苷酸，可增強呈味性；在魚罐頭等水產品中添加酵母抽提物，可以掩蓋魚腥味[7]。近年來，我國的醬油、調味醬產業發展穩健，是食品工業中不可分割的組成部分，以酵母RNA為原料生產新一代調味品以及健康型食品添加劑將成為熱點方向。

1.2 營養功能與應用

作為構成生命最基本物質之一的RNA在生物遺傳、變異、生長發育以及蛋白質合成等方面起著重要作用。核酸功能的改變是一些疾病發病的重要因素，如惡性腫瘤、病毒性疾病、遺傳性疾病等，所以核酸類藥物對防治這幾類危害性巨大的疾病有著重大的意義。利用酵母RNA來開發核酸類藥物也正在成為醫藥保健領域的主流，比如核酸降解產物三磷酸腺苷是一種有效的心肌梗塞搶救藥物，還可以用于冠心病的預防[8]。除此之外，研究者們在動物實驗中還發現酵母RNA具有提高免疫力、保護肝臟、增加食欲以及延緩衰老的功能。核酸型膳食對高血壓、高血脂、動脈粥樣硬化病具有改善功效[9]；外源性ATP對腫瘤增殖和細胞凋亡分別具有抵抗和誘導作用；三磷酸胞苷(CTP)對突發性耳聾具有治療痊愈功能[10]。

RNA的保健功能已被挖掘與接受，廣泛應用于保健食品、嬰兒奶粉等，由RNA和DNA、維生素C等組合的制品，也得到了市場認可并獲得多項專利，酵母來源的RNA，更是用作具有保健、營養強化等功能食品原料的代表。例如，國外已經出現許多核酸類保健產品，如核酸健腦素、核酸豆腐、KR核酸等，這些產品已經投入市場并受到了消費者的廣泛追捧。國內自主研發的核酸類產品還是鳳毛麟角，所以利用酵母RNA生產核苷酸及其衍生物，并將其應用到營養保健品與藥物治療中具有很高的應用價值和前景。

1.3 其他功能與應用

在食品領域中，除了用作食品添加劑外，還可以把RNA與其他核酸類物質相配合制成功能性食品[11]，這種食品不僅可以起到補充核酸；促進核酸代謝的作用，而且還可以防止機體衰老，強化免疫功能，進而實現人們追求日常保健的目的。此外，RNA及其降解物的衍生物可以生產抗菌素農藥來防治植物病菌，值得一提的是，這類農藥無毒害、無污染，是一種環境友好型的新型農藥，對環境保護、飲食健康方面有重要的意義。RNA及其水解物還可以作為一種生長素，這種生產素可以促進作物生長、結果，達到增產的效果，用于農業生產上將會帶來很大的經濟效益。甚至對于日常接觸的化妝品，將RNA添加到其中，也可以達到滋潤皮膚、促進蛋白質合成的效果[12]。

綜上可知，目前RNA的應用多集中于食品、醫藥、保健、農業等行業，所以開發更多RNA的應用價值，甚至擴寬RNA的應用領域，將會對酵母RNA的研究生產具有非常重要的推動作用。

2 酵母RNA的生產技術

早期工業生產中有利用新鮮的動物肝臟來提取RNA，但是由于這種原料存在弊端，且產品收率低、價格昂貴、污染嚴重，所以應當采用更經濟合理的RNA制取方法。20世紀90年代有研究從味精生產廢水中提取核糖核酸[13]，主要是因為這種廢水中含有1%～2%富含RNA的菌體，從而為RNA的制取開辟了一條綠色經濟途徑。國內多用淀粉廠廢水、豆腐廢水培養白地霉，然后進行RNA提取，這一方法可以達到改善環境污染的目的[14]。在分子技術方面，人們對高效、穩定地生產短RNA分子的需求越來越大，有研究對T7RNA聚合酶體外轉錄法進行了改進，提出轉錄目標RNA序列的串聯重復序列，再定點切割以獲得高純度和高產量的RNA[15]。此外，還有體內發酵生產RNA等多種新技術不斷出現。

關于從酵母菌體內提取RNA的研究較多，酵母RNA提取主要分破壁、除蛋白、離心三步進行，再調等電點，沉淀后經純化、干燥得到成品。作為提取首要步驟的破壁，此類方法有機械、化學和酶法破壁等多種方法，易弋等[16]比較了液氮碾磨、反復凍融、超聲波、加玻璃珠漩渦振蕩和蝸牛酶酶解5種破壁方法提取酵母菌總RNA的差異，結果表明反復凍融和液氮碾磨是其中最為有效且簡便的酵母菌細胞壁破碎方法。Miguel L的實驗數據則表明，冷凍酵母細胞在超低溫下的機械破碎是純化完整RNA復合物的首選裂解方法[17]。

實際實驗中往往需要對數量較多的菌株進行RNA含量的測定，為了提高實驗效率，高效的RNA提取測定方法必定是一個突破口。龍燕等[18]對比Trizol法、熱酚法、酵母RNA提取試劑盒法3種方法，發現酵母RNA提取試劑盒法是較為有效且簡便的方法。B?hler等[19]的研究創新性地使用了相鎖凝膠(一種可作為物理屏障的惰性材料)分離水相和有機相來完成脫蛋白，該方法可用于從多個平行生長的培養基中提取RNA，進而提高效率。Wang等[20]在室溫下用Fe2(SO4)3進行鄰苯二胺的化學氧化聚合反應形成復合材料，該復合物作為熒光探針可用于酵母RNA的快速測定。這些新的RNA高效提取技術有很多優點，在后期研究中應當提倡應用這些技術，提高實驗效率。

3 高RNA酵母菌株的選育

3.1 高RNA酵母菌種的來源及特性

3.1.1 高RNA酵母菌種的來源

不同微生物細胞內的RNA含量差異較大，通常細菌中RNA含量為5%～25%，酵母為2.7%～15%，霉菌為0.7%～28%。其中，酵母中以熱帶假絲酵母RNA的含量較高，可達8%以上，但是念珠菌類沒有被歸類為公認的安全菌株，因此從熱帶假絲酵母中分離出的RNA作為食品添加劑使用時受到了嚴格控制。其次，念珠菌菌株的生長速度比釀酒酵母慢，故該類菌株的選育效率和應用價值相對較低。在一些發酵液和某些生產廢液、廢渣中也有一些富含RNA的菌體，這些菌體也可用來制取RNA，達到綠色環保的目的。在啤酒酵母中RNA含量可高達6%～8%，目前則多以啤酒酵母提取RNA，這種方法具有工藝簡單、成本低、應用安全性高等優點，可作為高RNA酵母選育的優選菌株，以及生產RNA的有效途徑。

表1 不同微生物中RNA的含量比較

3.1.2 高RNA酵母菌種的特性

高RNA酵母菌種在細胞形態、菌落特征等方面變化不大，細胞直徑約為2～6 μm，呈橢球形，以出芽方式無性繁殖，在固體培養基平板上28 ℃培養24 h后，為乳白色、不透明、圓形菌落[21]。特殊的是，國外有學者篩選了一系列熱帶假絲酵母，通過研究發現含高核苷酸的酵母菌株對鉀比較敏感，但是具體的分子機制尚不清楚，國內也已有一些研究在篩選培養基中加入一定量的氯化鉀來對誘變后的高RNA含量菌株進行篩選[22-23]，這對目的菌株的篩選效率提升有較大意義。

通過大量的提取工藝對比發現，利用培養高RNA含量酵母來生產RNA的方法具有很多優勢：第一，酵母RNA含量普遍高于其他微生物，且提取容易，與DNA含量的比例差距也很大；第二，菌體更容易收集，容易生產出優質的RNA；第三，高RNA酵母對培養基條件的要求極低，可連續培養，脫核酵母可作為優質的蛋白飼料，經濟效益相對提高。

3.2 高RNA酵母菌種的選育研究

酵母的選育方法有很多，包括自然篩選、雜交、突變、原生質體融合以及基因工程等技術。目前大多采用自然篩選以及不定向誘變法育種高RNA酵母菌株，步驟主要為：菌種的純化和活化，自然培養或誘變育種，RNA等指標測定，發酵復篩，菌種鑒定。

3.2.1 誘變育種技術

自然篩選是獲得高RNA酵母的有效途徑，而誘變育種可大幅度提高突變率，從而選育到性能更加優良的菌種。以微生物的自然變異作為基礎的生產選種的幾率并不是很高，因為這種變異率太小，一個基因的自然突變頻率僅在10-8～10-10左右。為了加大其變異頻率，可采用物理或化學因素促進誘發突變。這種以誘發突變為基礎的育種就是誘變育種，是迄今為止國內外提高菌種產量、性能的主要手段[24]。

陳文明等通過搖瓶初篩以及發酵罐復篩從眾多酵母菌株中挑選出了性能最優的酵母菌株J-5，RNA含量達9.86%，為酵母抽提物生產優良酵母菌株。進一步進行誘變選育后，得到了一株RNA含量更高的誘變菌株J-5-9，再通過高密度培養工藝使RNA產量比優化前提高了18.22%[25]。倪曉豐等[26]以DES誘變釀酒酵母BY23，篩選出了一株生長性能好、胞內RNA含量高的突變株。李小坤的研究中則是采用了常壓室溫等離子體(ARTP)技術進行釀酒酵母誘變育種。為了提高誘變效率和效果，往往還可以采用復合誘變的方式，比如紫外-氟尿嘧啶復合誘變法等[27]。

3.2.2 基因工程技術

基因工程技術是運用體外DNA各種操作或修改手法獲得目的基因，再借助于病毒、細菌質粒或其他載體，將目的基因轉移至新的宿主細胞并使其在新的宿主細胞系統內進行復制和表達，或者通過細胞間的相互作用，使一個細胞的優秀性狀經其間遺傳物質的交換而轉移給另一個細胞的方法[28]。Yu 等[29]發現將必要rRNA轉錄調節因子RRN5重新引入到Sup16突變體(FOB1基因編碼rDNA復制叉屏障網站結合蛋白被破壞)后導致其與野生型相比RNA含量顯著增加了17%。Chuwattanakul等[30]已經開發了一種三步育種程序來產生具有高RNA含量的釀酒酵母菌株的策略：第一步，構建RRN10基因的釀酒酵母破壞子，它是rRNA轉錄的UAF(上游激活因子)復合物的成分之一，并顯示出嚴重的緩慢生長；第二步，分離出7個抑制因子，恢復RRN10干擾物的緩慢生長；第三步，RRN10野生型基因被整合到每個原始抑制子的第五染色體中。最后得到的整合子的總核糖核酸含量比野生型菌株高1.4～2.3倍。因為FHL1基因的缺失會導致RNA含量下降80%，IFH1基因編碼的蛋白參與核糖體的生物合成，SSF1/SSF2基因可以促進細胞的遺傳能力，而HRP1基因的過量表達會導致酵母生長速度緩慢，Guo等[31]則通過同時過量表達FHL1、IFH1、SSF2和缺失HRP1，構建了高RNA產量菌株W112，其RNA含量比親本高38.8%。

3.3 高RNA酵母的高密度培養技術

高密度培養技術一般指微生物在液體培養中細胞群體密度超過常規培養10倍以上時的生長狀態的培養技術[32]。通過提升在一定菌液內菌體數目的方法，來獲得更多的菌體，進而獲得更多的產物。相較于常規培養，高密度培養具有生產率高、生產成本低、培養體積小、過程安全、下游產物處理方便、發酵周期短、工業污水少、產物效價高等優點[33]。

一般來說，菌體生長越快，個體越大，其RNA含量也越高，隨著生長速率的變化，每個細胞RNA不同時期差異可達10倍之多，在快速生長的細胞尤其是在對數生長時期RNA的含量可以達到細胞重量的30%，此外不能使用發酵許多周期的酵母，因為它們的活力下降也會影響RNA的產量[34]。

3.3.1 培養基條件優化

后期培養中，菌體RNA含量與培養基成分有很大的關聯。故根據酵母菌體生長所需的不同營養成分來選擇合適的、針對性的培養基組分及配比，對菌體內核酸含量的提高具有重要的意義。

碳、氮、磷源是微生物培養的三大營養素，對于酵母培養以及RNA的積累具有十分重要的作用。陳文明等[35]對高產RNA釀酒酵母基礎發酵培養基的碳、氮、磷成分進行了優化，發現釀酒酵母J-5體內RNA積累量提高到了12.6%以上。盛建國等[36]發現，對比原糖液、廢糖蜜等幾種不同的碳源在培養菌株時，以原糖液為碳源，K-79酵母的RNA含量可提升至8.6%。黃芳等選取糖蜜為碳源，酵母粉和氯化銨為混合氮源，NaH2PO4·2H2O為磷源，發酵培養后的菌體RNA產量比優化前提高了35.6%。由于酵母的活動少不了微量元素的參與，所以在培養基中要加入適當濃度的鎂、鋅和鐵等微量元素將促進酵母的生命活動，該實驗研究得到了MgSO4·7H2O 0.20%、FeSO4·7H2O 0.05%、ZnSO4·7H2O 0.10%的優化培養基微量元素配方。

另外，由于生物合成酵母細胞中的嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸需要谷氨酰胺、天冬氨酸的直接參與，所以在培養基中加入一定含量的谷氨酰胺、天冬氨酸可以使酵母的RNA含量提高。周震等[37]在酵母培養時加入0.3%含量的谷氨酰胺后發現實驗菌株(熱帶假絲酵母QZN0209)RNA含量提高了30%。

3.3.2 發酵工藝優化

發酵工藝對于酵母RNA的積累也尤為重要，各種工藝條件都對酵母RNA含量有著或大或小的作用。在氧氣充足的情況下，酵母細胞具有較高的生長速率，分裂增殖迅速；一定范圍內培養溫度的提高，也能使酵母的生長速率相對增大，引起RNA含量升高，并且實驗表明酵母RNA的積累在溫度為32～33 ℃時最有效。所以，為了保證菌株RNA產量的提高，需要在發酵溫度、接種量、發酵時間、搖床轉速、初始pH、生長期等方面進行優化，找到最適的工藝條件，這樣才能在后期培養中達到菌體RNA含量提升的效果。

俞燦等通過利用優化發酵培養基和流加補料工藝，實現了誘變選育的釀酒酵母菌株J-5-9的高密度發酵，酵母RNA含量提高了18.22%。黃芳等的研究則驗證了核酸含量在對數生長期含量最高的結論，該實驗發現在酵母生長0～3 h時，RNA含量開始逐漸積累，3 h時含量最高。Zhang等[38]則通過在搖床發酵條件下對啤酒酵母菌QH633的發酵培養進行優化，優化后酵母RNA的含量增加了34.97%。

4 總結與展望

酵母RNA及其降解產物核苷酸在醫藥、保健品和食品加工業方面有非常廣泛的應用前景，但由于目前RNA產品的質量和價格因素限制了它的使用。所以,如何高效提取酵母RNA，并提高其純度與產量成為科技工作者研究的重要方向。

通過上述研究分析，實現酵母生產RNA的最有效、最高產途徑主要有以下幾個方面：富含核糖核酸的原始酵母菌株的篩選；高效率針對性篩選培養基的設計；高效且保證質量的RNA提取測定；后期培養條件優化；高密度發酵培養工藝的采用。以此來達到盡可能從出發菌株到后期培養不斷得到更高的RNA產量的目的。

不難發現，高效的篩選方法也是目前高RNA酵母中選育工作較難解決的問題，對于要從數量眾多的酵母篩選出目的菌株的工作來說，傳統的高核酸酵母篩選工作無法直接反映RNA含量，可謂工作量繁重。目前除了部分研究者利用高RNA酵母氯化鉀敏感性來直接篩選外，一些其他方法還處于創新階段，所以設計出可以直接篩選出目的菌株的培養基或是利用其他高效篩選技術體系將會成為一個重點方向。

高RNA酵母菌種選育的常用技術中也存在一些弊端，比如誘變育種技術雖然對設備要求低，操作也較為方便，但是突變方向往往不確定。目前在酵母選育領域還有很多其他高效準確的技術，尚未應用到高RNA酵母選育研究上來，但是這些技術的獨特優勢可以作為在高RNA酵母選育方面的創新源泉，比如基因組重排技術、原生質體融合技術、進化工程選育技術、代謝工程技術等。將這些技術應用到高RNA酵母選育研究中，在提高RNA產量的同時，還能賦予酵母其他如耐受性等優良性狀，同時對實現培養與篩選便利性具有十分重要的推動作用，從而更好地加快高RNA酵母的選育進程。