結直腸腺瘤中的miR- 218- 5p 表達研究

朱海龍 朱旭友

1.上海市閔行區腫瘤醫院腫瘤內科，上海 200240；2.上海市同濟醫院病理科，上海 200065

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是世界范圍內的常見惡性腫瘤之一。 據統計，全球每年CRC 新發病例約120 萬[1]。我國CRC 的發病率和死亡率呈逐年上升之態勢，已成為國民健康的主要威脅之一[2]。 Fearon和Vogelstein 提出的正常黏膜-腺瘤-癌通路被視作CRC 的經典遺傳模型[3]。 近年來，隨著鋸齒狀腺癌（serrated adenocarcinoma，SAC） 概念的提出， 尤其是SAC 正式列為CRC 的獨立亞型以來， 一種被稱作鋸齒狀通路的全新遺傳模式進入人們的視野[4]。然而，無論是傳統的腺瘤-癌通路，還是新近的鋸齒狀通路，都認為CRC 來自于腺瘤的惡性演變[5]。但到目前為止，推動CRA 癌變的分子機制尚未完全闡明。其中APC、p53、KRAS、BRAF 等基因的突變，以及染色體不穩定性 （chromosomal instability，CIN）、CpG 島甲基化表型（CpG island methylator phenotype，CIMP） 和微衛星不穩定性（microsatellite instability，MSI）等表觀遺傳改變被證實為腺瘤癌變的原動力[6]。 最近多項研究顯示[7-11]，miR-218 在CRC、腺瘤和正常組織中存在差異化表達，并證實miR-218 具有抑癌作用，提示miR-218是潛在的CRC 調控靶點。 但miR-218 在結直腸腺瘤（colorectal adenoma，CRA） 中的研究卻鮮有報道。 因此，本研究在檢測miR-218 成熟體miR-218-5p 表達的基礎上，分析不同病理參數下的miR-218-5p 表達差異，為CRA 癌變機制的闡明提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2011 年1 月至2013 年12 月上海市同濟醫院的16 例結直腸腺瘤CRA 及8 例非腺瘤（non-adenoma，NA）石蠟組織作為研究對象，16 例 CRA 中，8例為傳統腺瘤（conventional adenoma，CA），8 例為鋸齒狀腺瘤（serrated adenoma，SA）。 依據 2010 年版WHO 標準[12]將 CA 分為管狀腺瘤（tubular adenoma，TA）、絨毛狀腺瘤（villous adenoma，VA）和管狀絨毛狀腺瘤（tubulovillous adenoma，TVA）；SA 分為無蒂鋸齒狀腺瘤（sessile serrated adenoma，SSA）和傳統鋸齒狀腺瘤（traditional serrated adenoma，TSA）。 本研究經醫院醫學倫理委員會審核批準。

1.2 試劑設備

石蠟包埋組織RNA 提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司、SYBRTMPremix Ex TaqTM及 Prime-ScriptTMRT reagent Kit 購自寶生物工程（大連）有限公司 、U6 snRNA qPCR Primer 及 hsa-miR-218-5p qRT-PCR Primer 購自廣州市銳博生物科技有限公司；輪轉切片機RM-2235 型（德國 Leica 公司）、顯微鏡及拍照 Eclipse TI-s 系統（日本 Nikon 公司）、PCR儀GeneAmpR9700 型（美國 Applied Biosystems 公司）、Real time PCR 儀 LightCycler 1.5 型（瑞士 Roche 公司）、低溫高速離心機（德國Eppendorf 公司）。

1.3 miR-218-5p 表達檢測

參考TIANGENRRNAprep Pure FFPE Kit 說明書，經組織脫蠟、洗滌二甲苯、裂解蛋白、去除DNA 及蛋白、溶解收集等步驟提取石蠟組織RNA。隨后以RNA為模板， 參照 PrimeScriptTMRT reagent Kit 及 Bulge-LoopTMmiRNA qRT-PCT Primer 說明書，利用 PCR儀，調整反應參數為42℃ 60 min，70℃ 10 min 進行miR-218-5p 及內參 U6 snRNA 的逆轉錄（reverse transcription，RT）。 最后以 RT 產物為模板， 參照 SYBRRPremix Ex TaqTM及Bulge-LoopTMmiRNA qRT-PCT Primer 說明書， 利用Real time PCR 儀進行實時定量PCR 反應（Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR，qRT-PCR）， 檢測 miR-218-5p 的相對表達量。

1.4 miR-218-5p 表達分析

qRT-PCR 結束后記錄各樣本的Ct 值。 參考文獻報道[13]的方法：以人 U6 snRNA 為內參，ΔCt =miR-218-5p Ct 值-U6 snRNA Ct 值， 同一樣本各復孔的－ΔCt 平均值即為miR-218-5p 的相對表達量。

1.5 觀察指標及評價標準

分析比較 NA 與 CRA、NA 與 CA、NA 與 SA 中的miR-218-5p 表達。 評估不同年齡、性別，尺寸、位置、數量、病理類型，以及是否伴發同時性CRC（synchronous colorectal carcinoma，sCRC）等亞組腺瘤中的miR-218-5p 表達差異。 其中息肉尺寸依據結腸鏡下的觀察記錄，取最大直徑作為息肉尺寸；息肉的位置同樣依據結腸鏡下的觀察記錄，分為近端（包括盲腸、升結腸、橫結腸）和遠端（降結腸、乙狀結腸、直腸）。

1.6 統計學方法

采用Prism 6.0 軟件制圖，采用SPSS 17.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用獨立樣本t 檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-218-5p 在 CRA 與 NA 中的表達比較

24 例石蠟組織中，有 8 例 CRA（SA 與 CA 各 4例）和7 例NA 能提取出符合純度要求的RNA，且成功完成 qRT-PCR 檢測。 結果顯示：CRA 與 NA 兩 組的miR-218-5p 表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05，圖 1A）。 亞組分析顯示：CA 與 NA 兩組的 miR-218-5p 表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05，圖 1B）；而SA 組中的miR-218-5p 表達低于NA 組，差異有統計學意義（t=3.478，P=0.007，圖 1C）。

圖1 miR-218-5p 在CRA 與 NA 中的表達比較

2.2 不同病理特征的miR-218-5p 表達比較

不同性別、年齡、尺寸、位置、數量及病理類型情況下的miR-218-5p 表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。 伴發 sCRC 的 CRA 中的 miR-218-5p 表達低于不伴sCRC 的CRA，差異有統計學意義（t=2.556，P=0.043）（表 1）。

表1 不同病理特征的miR-218-5p 表達比較（n=8）

3 討論

CRC 是世界范圍內的主要腫瘤，其發病率位居全球惡性腫瘤第三位[4]。 研究證實[6]，CRC 是因錯配修復、原癌、抑癌等諸多基因突變所致的異質性疾病。目前，APC、p53、KRAS、BRAF 突變， 以及 CIN、CIMP、MSI 等分子事件被證實與CRA 癌變有關[14-16]。但CRC形成的分子機制遠未被完全闡明。最近Gattolliat 等[17]利用qRT-PCR 技術證實CRA 和CRC 之間存在差異表達的 miRNA。 與此同時，Slattery 等[13]以 Agilent Human miRNA Microarray V19.0 為平臺進行差異miRNA 篩選， 結果顯示CRA、CRC 與正常黏膜之間同樣存在差異表達的miRNA，提示miRNA 可能參與正常黏膜-CRA-CRC 的惡性演變。miR-218 是位于SLIT2/3基因編碼區的內含子miRNA。成熟的miR-218 來自兩個獨立的基因座，其中miR-218-1 位于染色體4p15.31 的 SLIT2 基因編碼區，miR-218-2 則位于染色體5q35.1 的SLIT3 基因編碼區，而 miR-218-5p 是兩者共同的成熟體[18]。 作為miRNA 的成員之一，研究證實miR-218-5p 與胃癌、 肝癌、CRC 等眾多腫瘤的增殖、轉移相關[5-9]。 Deng 等[8]的研究顯示，胃癌中的miR-218 存在下調表達，而且低表達的miR-218 與較晚的臨床分期、淋巴結轉移、遠處轉移，以及不良的生存預后相關； 上調miR-218 的表達不僅可以誘導胃癌細胞發生G1 期阻滯、抑制胃癌細胞增殖，還能調控胃癌的生長和轉移。 Ting 等[7]對肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）中的 miR-218 表達進行了研究，結果HCC 中的miR-218 表達下調；功能獲得試驗顯示， 提高miR-218 在HCC 細胞中的表達可抑制細胞的侵襲遷移，并能逆轉上皮-間質轉化（epithelialmesenchymal transition，EMT）。 此外，Zhang 等[7]對 CRC組織和細胞的miR-218 表達進行了檢測， 證實了miR-218 在 CRC 中同樣存在下調表達，miR-218 過表達可抑制CRC 細胞LoVo 的增殖、侵襲及遷移。 進一步研究提示，miR-218 可能通過調控PI3K/Akt/mTOR 通路活性來實現其抑癌作用。 本研究結果顯示，伴發sCRC 的腺瘤組織miR-218-5p 表達量低于不伴癌的腺瘤組織（P=0.043），與上述文獻報道相似。 本研究結果還顯示，作為CRA 亞型之一的SA，其miR-218-5p 表達較NA 下調，差異有統計學意義（P=0.007）； 而 miR-218-5p 在 CA 和 NA 中的表達比較，差異無統計學意義，提示SA 是有別于CA 的獨特CRA亞型。

綜上所述，miR-218-5p 在 CRA 亞型 SA，以及伴有sCRC 的腺瘤中表達下調， 提示miR-218-5p 可能成為SA 診斷的候選指標。 此外需要說明的是，相較新鮮組織，使用石蠟組織提取RNA 要困難的多，這是造成本研究樣本量偏少，導致研究結果局限的關鍵因素，也是今后深入研究中亟需改進的問題。