M2型巨噬細胞來源的外泌體對類風濕關節炎小鼠的作用及其機制研究*

聞君俠，王瑾，江彬鋒，翟利鋒，劉建

（浙江省立同德醫院 骨傷科，浙江 杭州 310012）

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis,RA）是一種世界性高發的自身免疫性疾病，其發病率高達1%[1-2]，是骨骼和軟骨炎癥損傷導致的關節腫脹和變形。RA 常伴隨關節受累、身體功能失調，嚴重者可致殘疾，影響患者及家人的生活質量[3]。目前，RA 的臨床治療主要采用糖皮質激素和非甾體抗炎藥，如經典的抗風濕性藥物氨甲喋呤，雖然可以緩解臨床癥狀，但長期使用有肝毒性及致畸等嚴重副作用[4]；再如抗TNF-α 抗體，可明顯抑制炎癥反應，但伴隨免疫系統下降，也增加患者的感染風險，此外高額的費用也限制其在臨床的廣泛應用[5-6]。鑒于此，研究RA 安全有效的治療方案具有顯著的現實意義。

巨噬細胞是機體最常見的防御性免疫細胞之一，在炎癥相關性疾病的發生、發展中扮演重要角色[7]?；ぶ械木奘杉毎ㄟ^分泌多種炎癥因子及基質金屬蛋白酶等介質促進炎癥反應，在調控RA 發病過程中起關鍵作用[8-12]。已有研究[13]表明，M2 型巨噬細胞衍生的外泌體（M2-Exo）在體外能夠誘導M1 重新編程，上調精氨酸酶（Arginase）（M2標記），下調誘導型一氧化氮合酶（iNOS）（M1 標記）的表達，完全轉化為M2 型巨噬細胞，表現出M2 型巨噬細胞獨特的表型和功能特征。此外，M2-Exo 不僅具有重編程巨噬細胞的功能，而且有促進傷口愈合的各種細胞因子和生長因子[14]。

本研究采用超速離心法體外分離提取白細胞介素-4（Interleukin-4,IL-4）誘導的M2 型巨噬細胞，研究M2-Exo 對炎癥性M1 型巨噬細胞的表型標志物iNOS2、Arginase 表達分布的影響，探討M2-Exo 抗炎反應的分子機制，為外泌體調控關節組織的炎癥狀態及修復過程提供新的思路，為尋找RA 新的治療方案提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料

C57BL/6 小鼠10 只，雌性，6～8 周齡，體重（21.0±2.0）g；DBA/I 小鼠30 只，雌性，6～8 周齡，體重（25.0±2.5）g 均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。動物實驗均嚴格按照實驗動物指南進行，并經醫院倫理委員會批準[實驗動物許可證號SYXK（浙）2019-0010]。RPMI 1640 培養基及胎牛血清（美國Life 公司），脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）（L2880）（美國Sigma 公司），青霉素及鏈霉素（美國Invitrogen 公司），巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor,M-CSF）及IL-4（美國Peprotech 公司），DAPI 染色液（上海碧云天生物技術公司），BCA 蛋白測定試劑盒和Trizol 試劑（美國Thermo Scientific 公司），蘇木精-伊紅（HE）染色液（南京建成生物工程研究所），酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（上海西唐生物科技有限公司），iNOS（ab210823，美國Abcam 公司），Arginase（93668，美國CST 公司），F4/80（ab6640）、Alexa Fluor 488（ab150117）、Alexa Fluor 647（ab150083）（美國Abcam 公司）。Zetasizer 型Nanosight 可視型納米顆粒分析儀（荷蘭Malvern Panalytical 公司），35 mm 細胞培養皿（美國Corning 公司）。

1.2 M2 型巨噬細胞來源的外泌體的制備、鑒定及生物學功能

骨髓來源巨噬細胞（bone marrow-derived macrophages,BMDMs）的分離誘導：取10 只C57BL/6小鼠的股骨和脛骨，剪開兩端，打開骨腔，用10 ml注射器注射無菌磷酸鹽緩沖溶液（PBS）沖出骨髓，加入紅細胞裂解液重懸，冰上裂解10 min；完全培養基重懸后，以10 ng/ml M-CSF 誘導單核細胞向巨噬細胞分化，培養7 d 后置于含10 ng/ml IL-4 的完全培養基，誘導分化48 h 后，即得M2 型巨噬細胞。采用超速離心法分離M2-Exo[15]：將M2 型巨噬細胞在無血清條件下培養48 h，收集上清液，4℃1 000 r/min離心20 min，去除細胞，4 600 r/min 離心20 min，去除死細胞，9 000 r/min 離心1 h，去除細胞碎片，收集上清液，11 000 r/min 離心1.5 h，收集M2-Exo。PBS清洗1 次，去除污染蛋白，36 000 r/min 離心1.5 h，收集上清液待測。將M2-Exo 在2%多聚甲醛溶液中固定過夜，以25 000 r/min 離心1 h，懸浮于無水乙醇中。取2 μl 滴加到銅網上，晾干后通過透射電鏡（TEM）觀察M2-Exo 的形貌，以納米顆粒分析儀分析粒徑大小。將BMDMs 以3×105個細胞密度接種于細胞培養皿，培養過夜后，以LPS（100 ng/ml）刺激6 h 誘導為M1 型巨噬細胞，采用含50 μg/ml 的M2-Exo 無血清培養基37℃孵育24 h 備用。分離部分含M2-Exo 無血清孵育的M1型巨噬細胞，以36 000 r/min離心18 h去除外泌體，作為M0-Exo[16]。

1.3 RA模型的復制及分組

1.3.1 復制膠原誘導的RA模型[17]在低溫冰水浴條件下，將牛Ⅱ型膠原與完全弗氏佐劑以1∶1 等體積混合，使用勻漿器攪拌混合溶液，直到顏色變白、形狀黏稠，將乳化劑皮下注射于麻醉后的20 只DBA/1 小鼠尾根部，100 μl/只。在首次免疫注射后第21 天，進行第2 次注射，劑量同第1 次。實驗小鼠隨機編號，分為模型組和M2-Exo 組，每組10 只。另取10 只DBA/1 小鼠為對照組，同法注射生理鹽水。

1.3.2 M2-Exo 處理M2-Exo 組小鼠首次免疫注射后第16 天和第26 天采用關節腔注射方式進行原位給藥M2-Exo，100 μg/只，左右關節腔分別給予50 μg。模型組和對照組小鼠注射相同體積的生理鹽水。

1.4 觀察指標

①體重。每周稱體重，記錄3 組小鼠的生長狀況。②小鼠關節炎嚴重程度。監測小鼠RA 的發展情況，記錄RA 嚴重程度。參照關節炎指數（AI）評分[18]評價小鼠足爪腫脹情況：0 分，無紅腫；1 分，足小趾關節紅腫；2 分，趾關節、足跖均紅腫；3 分，踝關節以下均紅腫；4 分，包括踝關節在內的全部足爪紅腫。平均AI=每組小鼠AI 總和/只數。③小鼠前足腕部直徑、后足足墊厚度和關節炎評分。使用游標卡尺測量小鼠每只腳，測量3 次取平均值。

1.5 關節標本處理

免疫（首次注射）后第42 天，抽取所有小鼠的眼靜脈叢血，離心得血清，安樂法處死小鼠，解剖取關節標本。

1.6 ELISA 法檢測小鼠關節組織中炎癥細胞因子水平

將3 組小鼠的關節組織分別勻漿，采用ELISA法檢測小鼠關節勻漿上清液中白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-6（IL-6）水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.7 免疫熒光染色及Western blotting檢測

免疫熒光染色：將分離得到的M1 巨噬細胞以4%多聚甲醛固定，封閉后孵育相應的一抗M1（F4/80 和iNOS）和M2（F4/80 和Arginase）過夜，加入熒光二抗，DAPI 核染后封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察并分析。

采用Western blotting 分別檢測M1 型和M2 型巨噬細胞的iNOS 和Arginase 蛋白相對表達量。將細胞標本以PBS 清洗1 次，加入細胞裂解液，采用SDSPAGE 電泳分離，轉至PVDF 膜，封閉，置于一抗孵育，兔抗iNOS（工作濃度1∶1 000）和兔抗Arginase（工作濃度1∶1 000），二抗為含HRP 的山羊抗兔/小鼠抗體，化學發光凝膠成像系統曝光成像，內參為β-actin（工作濃度1∶4 000），采用Image J 圖像分析軟件檢測蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與內參蛋白灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.8 RT-PCR檢測小鼠關節腔M1和M2型巨噬細胞表面標志物mRNA的相對表達量

分離3 組小鼠的關節，采用RT-PCR 檢測M1型和M2 型巨噬細胞表面標志物mRNA 相對表達量。采用Trizol 法提取關節巨噬細胞RNA，以逆轉錄酶逆轉錄cDNA，引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 擴增條件：95℃預變性3 min（1 個循環），95℃變性30 s，60℃退火60 s，60℃延伸15 s，40 個循環。β-actin為內參。PCR 采集目的基因及內參基因的Ct 值，采用2-△△Ct法計算目的基因相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.9 統計學方法

數據分析采用SPSS 22.0 統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s>）表示，兩組比較采用t檢驗，多組間的比較用方差分析或重復測量設計的方差分析，進一步的兩兩比較用LSD-t檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 成功制備的M2-Exo 及對M1 型巨噬細胞的影響

TEM 結果表明，M2-Exo 呈現類圓形、有完整的包膜的囊狀結構（見圖1）。DLS 檢測結果顯示，M2-Exo 的粒徑均值44.1 nm（見圖2）。表明成功分離提取M2-Exo，可用于后續實驗。

圖1 M2-Exo的形態結構（TEM×10 000）

圖2 M2-Exo的粒徑分布

免疫熒光染色結果表明，與M0-Exo 處理比較，50 μg/ml 濃度的M2-Exo 可誘導M1 型巨噬細胞高表達Arginase，而iNOS 蛋白表達明顯下調（見圖3）。Western blotting 檢測結果表明，M0-Exo 處理的M1型巨噬細胞的Arginase 蛋白相對表達量為（0.25±0.06），M2-Exo 處理的M1 型巨噬細胞Arginase 蛋白相對表達量為（8.21±1.26），兩者比較，50 μg/ml濃度的M2-Exo 處理的Arginase 相對表達量高（t=14.110，P=0.000）；M0-Exo 處理的M1 型巨噬細胞的iNOS 蛋白相對表達量為（4.32±0.89），M2-Exo 處理的M1 型巨噬細胞的iNOS 蛋白相對表達量為（0.34±0.09），50 μg/ml 濃度的M2-Exo 處理的iNOS蛋白相對表達量低（t=9.949，P=0.000）（見圖4）。

圖3 M2-Exo刺激M1型巨噬細胞后表面分子的表達（免疫熒光染色×400）

圖4 M2-Exo和M2-Exo處理24 h的M1型巨噬細胞表面分子蛋白表達

2.2 M2-Exo可延緩AR小鼠的發病過程

對照組、模型組和M2-Exo 組在治療第16 天、第21 天、第26 天、第31 天和第36 天的AI 評分比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的AI 評分有差異（F=71.002，P=0.000）；②3 組的AI 評分有差異（F=401.238，P=0.000），模型組AI評分高于對照組，M2-Exo 組AI 評分低于模型組；③3 組的AI 評分變化趨勢有差異（F=217.634，P=0.000）。見表2和圖5。

圖5 3組小鼠在治療過程中的AI評分情況（n=10）

表2 3組小鼠AI評分比較（n=10）

2.3 M2-Exo 對3 組小鼠關節腫脹程度（足趾厚度）的影響

在M2-Exo 使用7 d 后，對照組小鼠的足趾厚度為（2.12±0.32）mm，模型組小鼠的足趾厚度為（3.75±0.19）mm，M2-Exo 組小鼠的足趾厚度為（2.82±0.53）mm，3 組小鼠的足趾厚度比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=45.972，P=0.000）；進一步兩兩比較，模型組和M2-Exo 組足趾厚度大于對照組，M2-Exo 組小于模型組（見圖6）。模型組第2 次免疫注射10 d 后小鼠前足腕關節和后足足墊及趾關節出現紅腫增厚現象，而M2-Exo 組后足紅腫明顯得到緩解（見圖7）。

圖6 3組小鼠關節腫脹程度（足趾厚度）的比較（n=10）

圖7 M2-Exo對3組小鼠關節腫脹程度的影響

2.4 3 組小鼠關節組織中TNF-α、IL-6 和IL-1β水平比較

3 組小鼠關節組織中TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平比較，差異有統計學意義（P<0.05）；進一步兩兩比較，M2-Exo 組小鼠關節組織的TNF-α、IL-6及IL-1β 水平較模型組明顯降低。見表3和圖8。

圖8 3組小鼠關節組織中TNF-α、IL-6和IL-1β水平的比較（n=10）

表3 3組小鼠關節組織中TNF-α、IL-6和IL-1β水平的比較（n=10，pg/ml）

2.5 3 組小鼠關節組織中M1 型和M2 型巨噬細胞的mRNA相對表達量比較

3 組小鼠關節組織中iNOS mRNA、CD86 mRNA、Arginase mRNA 和CD206 mRNA 相對表達量比較，差異有統計學意義（P<0.05）；進一步兩兩比較，M2-Exo 組關節組織中iNOS mRNA、CD86 mRNA 相對表達量低于模型組（P<0.05），Arginase mRNA 和CD206 mRNA 相對表達量高于模型組（P<0.05）。見表4和圖9。

圖9 3組小鼠關節組織中M1型和M2型巨噬細胞的mRNA相對表達量比較（n=10）

表4 3組小鼠關節組織中iNOS mRNA、CD86 mRNA、Arginase mRNA和CD206 mRNA相對表達量的比較（n=10）

3 討論

RA 是一種以滑膜炎癥、軟骨和關節骨質破壞及功能受損等為特征的慢性自身免疫性疾病。已往研究提示過度炎癥是RA 患者的病變特點，持續存在的抗原可引起機體內連續的免疫反應，表現為滑膜內炎癥細胞浸潤，參與RA 發病[19-20]。因此，溶解炎癥、調節免疫對RA 治療至關重要。巨噬細胞是重要的天然免疫細胞，具有趨化運動、吞噬、分泌多種炎癥介質等功能，在免疫防御中起著重要的作用。已有研究表明，巨噬細胞參與了RA 的發病機制?；さ木奘杉毎煞置谘装Y細胞因子白細胞介素-12（IL-12）、白細胞介素-23（IL-23）、IL-6 和TNF-α 和IL-1β，誘導T 細胞活化，加重滑膜的炎癥效應。另外，巨噬細胞產生B 細胞活化因子，促進產生抗體的B 細胞的增殖[21-22]。有研究報道[23]，巨噬細胞向抗炎狀態的轉化可明顯緩解RA和其他自身免疫性疾病的炎癥狀態，通過調控巨噬細胞表型轉換是治療RA 的潛在靶點。

近年來，許多研究報道了不同類型干細胞來源的外泌體具有再生的潛力。大多數研究只是簡單地將外泌體添加到受損的組織和器官中，組織結構和功能恢復的詳細機制尚不明確，探索外泌體如何通過操縱特定細胞表型來緩解疾病癥狀是很好的突破口。很多研究已證明使用外泌體作為自身免疫性疾病治療的潛力，包括Ⅰ型糖尿病、系統性紅斑狼瘡、炎癥性腸病及RA 等[24]，來源于人間充質干細胞的外泌體能夠參與修復骨關節炎退變軟骨[25]。另一項研究證實了人臍帶血來源的外泌體（UCB-Exos）通過下調巨噬細胞來源的白細胞介素-17（IL-17）的表達減輕葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導的炎癥性腸病[26]。由于外泌體在體內快速清除和相對較短的體內半衰期，其應用于自身免疫疾病的治療仍然面臨挑戰。

M1 表型是由Toll 樣受體激動劑LPS 或Th1 細胞因子如干擾素γ（IFN-γ）誘導，M2 表型可由Th2細胞因子IL-10 或IL-4 等激活。研究表明單核-巨噬細胞有相當大的表型可塑性，激活單核細胞可改變其表型和功能[27]?；诰奘杉毎目伤苄?，持續激活抗炎巨噬細胞在一定程度上可以改變病變組織的免疫環境，以達到抗炎的目的。為驗證M2-Exo 是否能夠誘導M1 型巨噬細胞的重編程，即由促炎的M1 表型向抗炎M2 表型轉換，本研究采用免疫熒光和Western blotting 檢測M2-Exo 處理的M1 型巨噬細胞，孵育24 h 后可看到M1 和M2 特異性標記iNOS 和Arginase 蛋白分別下調和上調?？紤]到關節腔存在一定的封閉性，通過2 次原位關節腔注射M2-Exo 治療膠原誘導的RA，發病表現為后足紅腫，與文獻報道類似[28-29]。在此期間，滑膜組織中促炎的M1 型巨噬細胞逐漸增多，與局部和全身性炎癥細胞因子的表達上調同步，因此在二次免疫前后5 d 進行干預治療，結果顯示，M2-Exo 組RA 小鼠后足紅腫減退，IA 評分顯著降低，促炎癥細胞因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 也明顯減少。研究顯示，促炎癥細胞因子參與肥胖、潰瘍性結腸炎和RA 等多種疾病的發生發展[30]，TNF-α、IL-6 和IL-1β 3 種促炎癥細胞因子可促進破骨細胞活化，參與滑膜成纖維細胞增殖活化及關節軟骨的破壞，擴大級聯炎癥效應[31]。本研究采用RT-PCR 檢測各組小鼠的關節組織中巨噬細胞的表型標志物mRNA相對表達量，M2-Exo 干預后激活經典M1 型巨噬細胞重編程為M2 型巨噬細胞，結果表明巨噬細胞來源的外泌體可以調控巨噬細胞激活的開關，體內外研究均證明了M2 型巨噬細胞來源的外泌體可以通過誘導巨噬細胞從M1 型向M2 型轉換。

綜上所述，本研究提出一種利用外泌體調控的細胞重編程的實驗室治療策略，將促炎的M1 型巨噬細胞直接轉化為抗炎的M2 型巨噬細胞，提高炎癥溶解效果，為RA 的治療提供新途徑。