MRTF-A的SUMO化對人臍靜脈內皮細胞遷移能力的影響*

谷巖，張蕊，何菊，劉輝

（天津市第一中心醫院 血管外科，天津 300192）

血管內皮細胞遷移是血管新生的重要環節，參與并影響受損血管修復、腫瘤生長和轉移等多種重要生理、病理過程[1]，研究影響血管生成的因素對一些疾病的診斷和治療具有重要意義[2-4]。SUMO（small ubiquitin-related modifier）是一種小泛素相關修飾物，通過改變其靶蛋白的功能參與多種疾病生理、病理過程。SUMO 分子修飾蛋白種類的多樣性使SUMO 在細胞內具有多種不同的生物學功能[5-7]。本研究通過對調控因子（MRTF-A）進行SUMO，探討其對CCN1 即富半胱氨酸61（cysteine rich 61,Cyr61）表達的調控及對人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）遷移的影響。

1 材料與方法

1 1 實驗材料

HUVECs 購自天津醫科大學，DMEM-F12 混合培養基（含10%胎牛血清）（美國Gibco 公司），質粒MRTF-A、SUMO1 和PIAS1/ UBC9（英國Abcam公司），MRTF-A 抗體、SUMO1 抗體、CCN1 抗體（英國Abcam 公司），GAPDH 抗體（美國Santa Cruz公司），抗小鼠和抗兔免疫球蛋白G（美國LI-COR Biosciences 公司），蛋白-DNA 復合物（美國Sigma-Aldrich 公司），Trizol（美國Invitrogen 公司），SYBR Green Master Mix 試劑（美國Applied Biosystems 公司），StepOnePlus 實時熒光定量PCR 儀（美國Applied Biosystems 公司），Odessay 紅外激光成像系統（美國LI-COR Biosciences 公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及質粒和細胞轉染將實驗分為兩部分，每部分分為5 組。第一部分第1 組為空白對照組，第2 組為轉染MRTF-A 組，第3 組為轉染MRTF-A、SUMO1 組，第4 組為轉染MRTF-A、UBC9 組，第5 組為轉染MRTF-A、SUMO1、UBC9組。第二部分第1 組為空白對照組，第2 組為轉染MRTF-A 組，第3 組 為轉染MRTF-A、SUMO1 組，第4 組為轉染MRTF-A、PIAS1 組，第5 組為轉染MRTF-A、SUMO1、PIAS1 組。除空白對照組，其余組統稱為實驗組。用TurboFect 轉染試劑轉染表達質粒（MRTF-A、SUMO1 和/或PIAS1/ UBC9）。48 h 后進行檢測。

1.2.2 染色質免疫共沉淀（co-IP）共轉染表達質粒的MRTF-A、SUMO1、UBC9、PIAS1。轉染48 h后收集裂解液。將MRTF-A 抗體（1∶1 000）加入磁珠，在整個細胞裂解液中沉淀MRTF-A。將得到的混合物洗滌后，經SDS-PAGE 處理，置于硝酸纖維素膜上，用特異性的SUMO1 抗體（1∶1 000）檢測MRTF-A 與SUMO1 蛋白間的相互作用。

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）用Trizol 裂解收集的細胞，采用隨機引物和M-MLV逆轉錄酶將提取的RNA 模板逆轉錄為cDNA。采用SYBR Green Master Mix、、StepOnePlus 實時熒光定量PCR 儀檢測CCN1 mRNA 相對表達。反應條件：95℃變性30 s，56℃退火45 s，GAPDH 退火54℃，72℃延伸30 s，共30 個循環。CCN1 引物序列：正向5'-AGCAGCGTTTCCCTAC-3'，反向5'-TGAGTCCCATCA CCCACA-3'；GAPDH 引物序列：正向5'-TCAACGGCA GTCAG-3'，反向5'-AGAAGGCGGAGATGA-3'。

1.2.4 Western blotting用SDS-PAGE 分離蛋白，然后分別用抗MRTF-A（1∶1 000），抗CCN1（1∶1 000）和抗GAPDH（1∶5 000）的抗體孵育膜，4℃孵育過夜。二抗為irdye -800 結合的抗小鼠和抗兔免疫球蛋白G（1∶2 000）。免疫反應性檢測采用Odessay 紅外激光成像系統。用Image J 軟件對蛋白相對表達量進行分析。

1.2.5 染色體免疫沉淀（ChIP）HUVECs 轉染MRTF-A、SUMO1、UBC9、PIAS1 48 h 后，室溫下以1%的最終濃度，將這些蛋白與DNA 交聯20 min。用MRTF-A 原抗體免疫沉淀蛋白-DNA 復合物（1∶2 000）。采 用PCR 法檢 測CCN1/MRTF-A 和CCN1/MRTF-A/SUMO1/UBC9/PIAS1 啟動子復合物的信號。用于CCN1 擴增的引物序列：正向5'-CAGGTTGCGT AGCCATCC-3'，反向5'-TGGTAGCCACCTGCCTCT-3'。

1.2.6 劃痕實驗在6 孔板中用無菌牙簽尖端在HUVECs 上劃痕，觀察0 h、48 h 損傷后的修復情況，并進行拍照。

1.2.7 Transwell 實驗在HUVECs 轉染SUMO1 和UBC9/PIAS1 后，用胰蛋白酶收集細胞。將細胞按1.0×104個/μl 密度接種到含1% DMEM-F12 培養基的Transwell 小室上層，下層加入600 μl 含有10%的DMEM-F12 的培養基。24 h 后用棉簽吸凈上室的細胞，將遷移至下室的細胞用4%多聚甲醛固定，并用DAPI 染色。分別在5 個視野（上、下、左、右、中）進行拍照計數。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 13.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s>）表示，比較用方差分析。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SUMO1對MRTF-A的體外修飾

Western blotting 檢測結果證實轉染MRTF-A、SUMO1、UBC9、PIAS1 后，HUVECs 相應過表達該基因（見圖1）。過表達SUMO1 和UBC9/PIAS1 增強MRTF-A的SUMO化（見圖2）。

圖1 MRTF-A/SUMO1/UBC9/PIAS1在HUVECs中過表達

圖2 過表達SUMO1和UBC9/PIAS1增強MRTF-A的SUMO化

2.2 MRTF-A的SUMO化調控CCN1的表達

HUVECs 分別轉染MRTF-A、SUMO-1、UBC9、PIAS1 48 h 后，qRT-PCR 和Western blotting 檢測CCN1 的表達。結果顯示，過表達MRTF-A 可轉錄激活CCN1基因，MRTF-A 與SUMO1 和UBC9/PIAS1 共轉染后，CCN1 表達降低（見圖3、4）。ChIP 分析證實MRTF-A 的SUMO 化抑制CCN1 啟動子上MRTF-A 的募集（見圖5）。HUVECs 過表達SUMO1、UBC9、PIAS1 抑制MRTF-A 對CCN1 的轉錄激活。

圖3 HUVECs轉染MRTF-A、SUMO1、UBC9、PIAS1 48 h后的CCN1mRNA表達

圖4 HUVECs中轉染MRTF-A、SUMO1、UBC9、PIAS1 48 h后蛋白相對表達量

圖5 MRTF-A的SUMO化抑制MRTF-A對CCN1的轉錄活性

2.3 SUMO1（△GG）喪失對MRTF-A的體外修飾功能

HUVECs 轉染UBC9、PIAS1、SUMO1（△GG），Western blotting 分析發現，UBC9、PIAS1 與缺失特定位點的SUMO1（△GG）共轉染后，MRTF-A 條帶的遷移速度并沒有減慢（見圖6）。此外，qRTPCR 和Western blotting 結果表明，SUMO1（△GG）和UBC9、PIAS1 并不影響MRTF-A 對CCN1 的靶向調控（見圖7、8）。ChIP 實驗也證實上述結果（見圖9）。該實驗結果表明SUMO1在MRTF-A調控中存在特定功能域。

圖6 HUVECs中轉染MRTF-A、SUMO1（△GG）、UBC9、PIAS1 48 h后MRTF-A的SUMO化表達

圖7 HUVECs轉染MRTF-A、SUMO1（△GG）、UBC9、PIAS1 48 h后的CCN1mRNA表達

圖8 HUVECs轉染MRTF-A、SUMO1（△GG）、UBC9、PIAS1 48 h后CCN1蛋白相對表達量

圖9 MRTF-A對CCN1的靶向調控

2.4 MRTF-A的SUMO化影響HUVECs的遷移

HUVECs 與MRTF-A、SUMO1 和UBC9、PIAS1共轉染后，劃痕和Transwell chamber 實驗結果表明。在HUVEC 單層形成“劃痕”后，從0 h 拍攝圖像看，MRTF-A 的SUMO 化顯著降低其遷移能力（見圖10）。在Transwell 實驗中，將轉染MRTF-A、SUMO1 和UBC9、PIAS1 或單獨轉染MRTF-A 的HUVECs 接種到Transwell 的上室。培養48 h 后，通過共聚焦掃描顯微鏡固定、染色、拍照、計數已經越過單層并遷移到膜下層的細胞。在單獨轉染MRTF-A 的細胞中觀察到細胞明顯的遷移和侵襲，而MRTF-A SUMO 化的細胞中，跨Transwell 室膜的遷移細胞減少40%（見圖11）。結果表明，MRTF-A的SUMO 化抑制HUVECs 的遷移。

圖10 HUVECs轉染MRTF-A、SUMO1、UBC9、PIAS1 48 h后劃痕實驗結果

圖11 HUVECs轉染MRTF-A、SUMO1、UBC9、PIAS1 48 h后HUVECs的遷移能力

3 討論

血管內皮細胞是覆蓋于血管內膜表層的單層扁平或多角形細胞，是構成血管內膜的基本元素，在血管內膜損傷的自我修復和血管新生過程中起決定作用。因此，探索和研究參與血管內皮細胞的調控分子，具有重要意義。

CCN1 是由CCN1基因編碼的分泌蛋白，CCN1 是胚胎發育過程中血管生成所必需的蛋白[8]，其在保持胚胎和胎盤的血管完整性方面發揮著重要的作用[9-10]。敲除CCN1 的小鼠在胚胎形成和胎兒發育過程中存在血管缺陷[11]。CCN1 還參與細胞的增殖、分化、凋亡和血管生成[12]。在不同的血管形成模型中，CCN1 可促進血管形成同時改善血流速度[13-14]。有證據表明，結締組織生長因子（CTGF）和CCN1 通過細胞表面整合蛋白介導調控內皮細胞功能和血管生成，可以促進內皮細胞生長、遷移和黏附[11]。

MRTF-A 是血清反應因子（SRF）的轉錄共激活因子，與CArG box（CC[A/T]6GG）結合調節血管生成。有研究表明，MRTF-A/SRF 在血管發育、遷移和侵襲中有重要作用[15-17]。此外，VEGF/MRTFA/SRF 信號通路可調控內皮細胞的侵襲和遷移。FRANCO 等[18]報道，使用特異性小干擾RNA 敲除HUVECs 中MRTFA 的表達，可引起肌球蛋白調控輕肽9（MYL9）、非肌球蛋白重鏈9（MYH9）和肌球蛋白重鏈10（MYH10）mRNA 水平顯著下調，進而抑制遷移。有報道顯示，MRTF-A 通過靶向調控CCN1 參與調控間充質干細胞向內皮細胞分化[19]。MRTF-A 及其組蛋白乙酰化參與調控CCN1基因，敲除MRTF-A 可顯著降低由于機械刺激引起的MRTF-A 缺失細胞中CCN1 的啟動子活性。在HEK 293T 細胞體外重建系統中，MRTFA 的SUMO 化抑制其表達與活性[20]。本研究中，MRTF-A 通過SRF 與CCN1 啟動子內的CArG box 結合，從而對CNN1 的表達起到調控作用。

SUMO 修飾蛋白種類的多樣性使其在細胞內具有多種不同的生物學功能。SUMO 通過改變DNA 結合活性、亞細胞定位和蛋白質穩定性來調控轉錄活性。PIAS 家族蛋白的功能與泛素化E3 連接酶相似[21-22]，E3 連接酶PIAS1 有助于SUMO 結合的效率和特異性[22-23]。UBC9 是一種重要的E2 結合酶，是泛素化蛋白共價修飾所必需的[24]。PIAS1 和UBC9均能增強特異性靶向蛋白的SUMO 化。本研究通過UBC9 和PIAS1 輔助MRTF-A 的SUMO 化，其對CCN1 表達的調控及HUVECs 的遷移有影響。

本研究中，HUVECs 在轉染MRTF-A 后，相應過表達CCN1基因。UBC9、PIAS1 協同SUMO1 抑制MRTF-A 的轉錄活性，進而影響HUVECs 的遷移。實驗結果證實過表達SUMO1 和PIAS1、UBC9 抑制MRTF-A 對CCN1 的轉錄激活。通過對不同位點的轉染研究中，筆者發現SUMO1 在MRTF-A 調控中存在特定功能域。在單獨轉染MRTF-A 的細胞中觀察到明顯的遷移和侵襲，而在顯示MRTF-A 的SUMO 化細胞中，跨Transwell 室膜的遷移細胞減少。研究結果表明，通過對MRTF-A 的SUMO 化抑制HUVECs 的遷移。