化學發光免疫分析法在梅毒篩查呈反應性無償獻血者歸隊管理的應用

李交 于艷濤 符發雄 葉偉亮 劉志泉 梁麗雯 朱慧娟 陳永飛 羅嬌娜 歐陽海寧

梅毒是由蒼白螺旋體導致的臨床常見的性傳播疾病。目前，血站系統主要使用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測無償獻血者血液中是否存在梅毒螺旋體抗體，實際應用中特異性較差，假陽性過多［1］，會造成合格獻血資源的浪費以及假陽性結果引起的獻血者心理恐慌。化學發光免疫分析法（CLIA）具有特異性好、敏感性高、方便自動化操作、重復性好等優點，已被廣泛應用于臨床血清學檢測，但在采供血機構的血液篩查中少用。我站將CLIA應用于梅毒酶聯免疫吸附試驗（TP-ELISA）篩查呈反應性的獻血者歸隊復檢檢測，本文初步探討CLIA在無償獻血者歸隊管理中的適用性，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019年3月至2020年12月在廣東省佛山市順德區中心血站應用ELISA法篩查陽性的183例梅毒反應性無償獻血者的標本。其中，男108例，女75例；年齡20～60歲，平均（39.98±9.78）歲。

1.2 試劑與儀器 梅毒螺旋體抗體診斷試劑盒（ELISA）購自上海科華生物工程股份有限公司，梅毒螺旋體抗體診斷試劑盒（ELISA）購自英科新創（廈門）科技有限公司，梅毒螺旋體抗體檢測試劑盒（CLIA）購自羅氏公司，梅毒螺旋體抗體檢測試劑盒（凝集法）購自珠海麗珠試劑股份有限公司。Xantus全自動加樣儀（深圳愛康公司），FAME ELISA全自動檢測分析儀（澳斯邦生物科技有限公司），電化學發光全自動免疫分析系統cobas 6000（e 601模塊）（羅氏公司）。

1.3 研究方法 采用兩個不同生產廠家的梅毒螺旋體感染標志物血清學檢測試劑（ELISA）對所有采集的無償獻血者血液標本進行初次試驗檢測，結果呈反應性的標本再以同一試驗對原血樣做雙孔復試，若雙孔復試結果至少有1種試劑仍為反應性，檢測結論為反應性。對ELISA檢測結論為反應性但感染狀態不確定的獻血者樣本進行梅毒螺旋體抗體CLIA檢測。ELISA和CLIA檢測結果不一致的標本，通過TPPA實驗進行確證。所有操作均按儀器和試劑盒說明書進行。判斷標準：化學發光法，以S/CO值≥1.00判定為陽性，S/CO值＜1.00則判定為陰性；酶聯法，吸光度≥cutoff值為陽性，吸光度＜cutoff值為陰性。

1.4 統計學方法 采用SPSS 26.0統計軟件。計數資料以例數/百分比表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 共篩查血液標本67 852份，檢測結論為反應性（陽性）的標本186例，陽性率為0.27%。其中，除3例因標本量不足外，另183例標本均同時進行CLIA檢測，檢測結果不一致的標本95例（CLIA檢測陰性結果、ELISA檢測陽性結果），再行TPPA確證試驗檢測。183例標本中，ELISA雙試劑（2個廠家ELISA試劑）檢測結論均為陽性結果的標本有87例，ELISA單試劑（1個廠家ELISA試劑）檢測結論為陽性結果的標本有96例。

2.2 標本檢測情況 血液標本采用CLIA法與ELISA法檢測梅毒螺旋體抗體的結果一致性比較，檢測結果一致的標本有88例，一致率為48.09%（88/183）。87例ELISA雙試劑陽性結果的標本中，CLIA檢測陽性結果的標本83例、陰性結果的標本4例，CLIA和ELISA兩種檢測方法陽性結果一致率為95.40%（83/87）。96例ELISA單試劑陽性結果的標本中，CLIA檢測陽性結果的標本有5例（4例-英科新創試劑、1例-上海科華試劑）、陰性結果的標本91例（24例-英科新創試劑、67例-上海科華試劑），兩種檢測方法的陽性結果一致率為5.21%（5/96）。ELISA檢測反應性標本中，ELISA雙試劑陽性結果標本和ELISA單試劑陽性結果標本分別與CLIA檢測結果比較，陽性結果一致率有顯著差異（χ2=5.55，P=0.018）。兩種檢測方法結果不一致的95例標本，進行TPPA確證試驗檢測，結果均為陰性。CLIA與TPPA檢測陰性結果一致率為100%（95/95），結果證實CLIA的假陽性率較低。

2.3 ELISA檢測結果的S/CO值分布與假陽性率的關系 ELISA檢測陽性結果的95例標本依據S/CO值大小對應陽性結果強弱分布（見表2），三組結果分布例數兩兩比較有統計學意義（χ2=22.34，P＜0.05）。結果證實，ELISA檢測陽性結果的標本，其S/CO值越低則假陽性率越高。

表2 ELISA檢測結果S/CO值分布與假陽性率的關系

2.4 ELISA檢測陽性結果的無償獻血者參加血站歸隊管理情況 化學發光法與TPPA結果均陰性的95名無償獻血者，其中34例主動參加血站無償獻血者的歸隊檢測（ELISA），占比35.79%。1例ELISA雙試劑陽性結果的獻血者，再次相同方法歸隊檢測的結果為陰性。28例ELISA單試劑陽性結果的獻血者，再次相同方法歸隊檢測的結果均為陰性。見表3。

表3 ELISA檢測陽性結果的無償獻血者參加血站歸隊檢測結果

3 討論

目前，國內外診斷梅毒主要依據實驗室特異性梅毒螺旋體抗體血清學檢測技術，主要有ELISA、TPPA、CLIA。其中，ELISA的應用最為廣泛，尤其是在采供血機構的血液檢測中；TPPA是現階段對梅毒螺旋體特異性抗體檢測判定的常用確證試驗之一；CLIA是臨床篩查梅毒感染研究較多的方法之一［2］，且靈敏度高、正確性高，檢測耗時短，但采供血機構應用較少。本研究將CLIA應用于ELISA檢測呈陽性反應性的無償獻血者的歸隊管理。根據國家衛生計生委統計，2016年我國梅毒報告發病例數超過43萬，居傳染病第3位，發病率高達31.967/10萬。2019年3月至2020年12月我站無償獻血者的梅毒篩查陽性率為0.27%。考慮到無償獻血者為傳染病低危人群，所以更應做好血液篩查梅毒呈反應性無償獻血者的歸隊管理工作。

本研究針對梅毒ELISA篩查陽性結果的無償獻血者標本，同時進行CLIA檢測，ELISA雙試劑陽性結果的標本占比95.40%，顯著高于單試劑陽性結果的標本（5.21%），差異有統計學意義（P＜0.05）。還將ELISA與CLIA結果不一致的標本進一步采用TPPA進行確證實驗檢測，結果全部為陰性，CLIA檢測陰性結果與TPPA確證陰性結果完全符合，證實CLIA的假陽性率較低。可見，ELISA檢測結果存在一定比例的假陽性，183例標本中占比51.91%（95/183）。95例確證結果陰性標本中有91例為單試劑陽性結果，可能與我站設置ELISA臨界值（CUTOFF）灰區（下調臨界值）有關。95例ELISA假陽性結果中，三組S/CO值的分布也有顯著差異（P＜0.05），還發現S/CO值越低則假陽性率越高。當ELISA結果S/CO值在1～2區間時，標本的假陽性率高達76.84%（73/95）。提示梅毒螺旋體抗體確證陽性結果的可能性較小，誤淘汰獻血者的機率較高，而這部分獻血者的歸隊管理需要重點關注，血站系統有必要將CLIA應用于歸隊管理中，降低血液篩查結果的假陽性率。

本研究中95名梅毒螺旋體抗體確證陰性的無償獻血者中，有34人主動參加了我站的無償獻血者歸隊檢測，占應參加歸隊無償獻血者的35.79%。可見還是有部分無償獻血者熱衷支持無償獻血公益事業。但在使用TP-ELISA篩查過程中，常有部分無償獻血者的梅毒螺旋體抗體檢測結果呈陽性反應，經確證試驗卻是陰性［3］，這種假陽性結果不僅浪費血液資源，還造成部分固定無償獻血者的流失，同時也給無償獻血者生活和心情都帶來一系列負面影響。現今血站系統的無償獻血者歸隊檢測策略是應用篩查項目陽性的ELISA試劑雙孔復檢相應的項目。因方法學不變，仍會出現假陽性的結果，導致無償獻血者無法獲得合格獻血資格而不能歸隊。本實驗中有5例無償獻血者歸隊檢測仍為陽性結果而無法順利歸隊，占比（5/34）14.71%。CLIA特異性好，假陽性率低于ELISA，已開始應用于醫院系統臨床感染性疾病的輔助診斷［4］。為了更好的保證每位獻血者的權利，可以將CLIA應用于無償獻血的歸隊檢測中。

ELISA對梅毒各期均有較高的靈敏度和特異性［5］，操作簡便，且價格容易接受，但也存在干擾因素多、重復性差等問題［6］。TPPA因特異性相對較好，甚至可達99.9%，常用做梅毒螺旋體抗體的確證實驗［7］，但TPPA試劑的價格昂貴，且操作較為復雜，檢測耗時較長，不能夠自動化判定結果，需要肉眼判斷，另外還較難保存，對操作者具有較高的水平要求，限制其在大規模篩查標本中的應用［8-9］。CLIA是酶免疫技術的新發展，在梅毒血清學檢測中具有高靈敏度、高特異性、自動化操作、高通量檢測、重復性好等優點，結果判斷更加客觀［10］，必要情況下可以補充應用TPPA，現在雖已被廣泛用于手術、輸血前的篩查試驗，但尚未在采供血機構中廣泛開展使用。2019版《血站技術操作規程》已明確規定CLIA可用于采供血機構輸血相關傳染病病原學標志物檢測，說明該方法已經獲得供血者篩查通用技術規范的認可。本研究應用CLIA對血站ELISA篩查反應性標本進行檢測，結果發現CLIA可應用于無償獻血者的歸隊檢測管理，為其在采供血機構的全面推廣應用提供數據支持。