82例卵巢癌患者胚系BRCA1/2基因突變分析及預后探索*

孫國棟，孟黃洋，姜旖，袁琳，周樹林，程文俊

210029 南京，南京醫科大學第一附屬醫院 婦科

卵巢癌約占全球女性死亡的4%，是死亡率最高的婦科惡性腫瘤[1]。絕大多數卵巢惡性腫瘤是上皮性卵巢癌，大多數患者發現時已是FIGO III/IV期,晚期卵巢癌患者的5年生存率僅為30%。目前，晚期上皮性卵巢癌的標準治療是最大程度的腫瘤細胞減滅術和以鉑類藥物為基礎的化療。盡管大多數卵巢癌患者可以從鉑類為基礎的一線化療中受益，但約80%的患者將在1～2年內復發，逐漸發展為鉑耐藥性卵巢癌[2]。因此，延長無進展生存期從而提高5年生存率是一個亟待解決的問題。

BRCA基因為重要的DNA同源修復基因，其突變會導致同源重組缺陷，從而損害基因穩定性并導致癌變。已有大量報道提示BRCA1/2突變的患者對化療的反應更好[3]。PARP抑制劑為BRCA突變患者的靶向藥物，在一線及二線維持治療方面已取得了顯著的成效。可以說，卵巢癌的治療已經進入了PARP抑制劑維持治療的新時代。而我國的卵巢癌BRCA基因檢測尚在起步階段，缺乏更大規模的多中心臨床研究。在這里，我們使用二代測序技術研究了本中心的卵巢癌患者胚系BRCA1/2突變特征，進一步闡明其與臨床病理特征的關系，初步探索其對預后的價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

本研究回顧性分析了2015年1月至2020年1月在南京醫科大學第一附屬醫院婦科接受治療，經初始腫瘤細胞減滅術或新輔助化療后行間歇性腫瘤細胞減滅術，病理確診的上皮性卵巢癌患者。化療方案均為紫杉醇+鉑類的TP方案。收集這些患者的高通量二代測序技術的胚系BRCA1/2基因檢測結果及臨床病理學資料。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 BRCA1/2基因檢測方法

采集患者的血樣送往基因檢測公司或我院病理科進行檢測。應用NGS技術檢測所有編碼外顯子及其鄰近±20 bp內含子區的BRCA1和BRCA2突變。使用特定的基因引物從原始樣本開始使用Sanger DNA測序來確認所有報道的變異。對突變的分類采用公認的5類分類：已知致病突變、疑似致病突變、意義未明突變、疑似良性變異、良性多態性變異。數據解讀規則和致病報道參考美國醫學遺傳學和基因組學學院(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)相關指南、乳腺癌信息核心數據庫(https://research.nhgri.nih.gov/bic/)、萊頓開放變異數據庫(http://www.lovd.nl/)、ClinVar(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)等數據庫[4]。

1.3 統計學方法

應用SPSS 22.0軟件進行統計學處理。采用卡方檢驗或確切概率法分析基因突變與患者臨床病理特征的關系。使用單因素及多因素COX回歸分析各臨床因素影響卵巢癌無進展生存期(progression-free survival,PFS)的差異，COX模型的PH假定均已驗證。使用R軟件中的Survival包做出Kaplan-Meier曲線描繪變量對于卵巢癌PFS的影響。以P<0.05為差異有統計學意義。

1.4 隨訪情況

隨訪由南京醫科大學第一附屬醫院婦產科2名隨訪專員每年按時進行，隨訪方式包括：門診、電話、微信、QQ、短信、信件等方式。隨訪時間為術后至患者死亡或60個月。隨訪過程中僅出現CA125升高而未出現影像學病灶，判定為生化復發；出現影像學病灶，判定為影像學復發。PFS為末次化療結束至影像學復發時間。結束鉑類藥物末次化療后12個月以上復發判定為鉑完全敏感復發，6～12個月判定為鉑部分敏感，6個月以內判定為鉑耐藥，從初始治療開始就未達到疾病緩解的患者判定為鉑難治。隨訪情況由專人登記。

2 結 果

2.1 患者的突變分析

共納入82例上皮性卵巢癌患者，共發現BRCA1致病性突變17例，突變率為20.73%，BRCA2致病性突變8例，突變率為9.75%，總突變率為30.48%。共檢測到BRCA1致病突變位點13個，其中c.2160delA、c.3770_3771delAG、c.5470_5477delATTGGGCA、c.3255_3259del(p.Leu1086fs)、c.3294del(p.pro1099fs)、c.4782del(p.Ser1595fs)、c.587dupA(p.Tyr196fs)、c.4065_4068delTCAA、c.4132delG這9個位點為移碼突變，其次c.3967C>G、c.1115G>A、c.4801A>T、C.6528C>G為錯義突變。BRCA2共檢測到7個致病突變，c.1495C>T、c.6528C>G、c.2041G>A、c.4593dupA為錯義突變,c.1499del(p.Gly500fs)、c.3770_3771dell(p.Glu1257fs)、c.6405_6409delCTTAA為移碼突變。其中c.4132delG位點、C.6528C>G位點臨床意義未明，無文獻報道，可能具有潛在的研究價值(表1)。

表1 25例胚系基因BRCA1/2突變位點及突變類型

2.2 患者的突變狀態與臨床病理分析

82例均為上皮性卵巢癌患者，其中I～II期12(14.6%)例，III～IV期70(86.4%)例；病理類型因素中，74例漿液性癌(90.2%)，8例非漿液性癌(9.8%)，具體為:5例透明細胞癌、3例子宮內膜樣癌；行新輔助化療患者42例，均為IIIC期及IV期患者。通過后期隨訪發現，82例患者中，31例(37.8%)為鉑完全敏感，32例(39%)為部分敏感；16例(19.6%)患者為鉑耐藥，3例(3.6%)患者為鉑難治；經影像學或術后病理確診，34例(41.5%)患者存在淋巴結轉移；49例(59.8%)患者有大網膜餅轉移；31例(37.8%)患者有膈頂轉移；21例(25.6%)患者存在結直腸侵犯；術前CA125值>500U/mL者51(62.2%)例。BRCA野生型組與突變組患者發病年齡、月經狀態、臨床分期、組織分化等臨床因素比較差異無統計學意義(P>0.05)。BRCA1/2基因致病突變狀態與病理類型、是否鉑敏感、是否新輔助化療相關，組間比較差異具有統計學意義(P<0.05,表2)。

表2 BRCA基因突變與臨床病理特征的關系

2.3 患者的突變狀態與預后分析

在對PFS相關的單因素Cox回歸分析中，只有BRCA1/2突變狀態(P=0.030;HR=0.43;95%CI:0.20～0.94)、大網膜餅(P=0.021;HR=2.27;95%CI:1.13～4.54)、侵犯結直腸(P=0.001;HR=2.87;95%CI:1.51～5.48)、是否鉑敏感(P<0.001;HR=0.02;95%CI:0.01～0.06)、是否新輔助化療(P=0.015;HR=2.24;95%CI:1.17～4.31)是有意義的預后因素(表3)。相應的生存曲線圖如圖1所示。BRCA突變組中位PFS為18.6個月，無突變組為12.8個月(P=0.030)。隨后將這5個因素納入多因素COX回歸分析中顯示，鉑敏感(P<0.001;HR=0.02;95%CI:0.01～0.07)和是否存在結直腸侵犯(P=0.005;HR=2.81;95%CI:1.39～5.69)為卵巢癌PFS的獨立預后因素。然而，BRCA突變狀態并非是卵巢癌PFS的獨立預后因素(表4)。

表3 82例卵巢癌臨床病理與PFS的單因素COX回歸分析

表4 82例卵巢癌臨床病理與PFS的多因素COX回歸分析

圖1 卵巢癌臨床病理特征與PFS的關系

3 討 論

近年來，許多研究揭示了BRCA1/2在DNA損傷修復機制中發揮的重要作用。BRCA1/2突變在具有潛在同源重組缺陷的細胞中可誘導合成致死[5]。BRCA基因的單核苷酸多態性和突變是導致BRCA基因結構和功能異常的主要原因[6]。目前臨床對攜帶BRCA1/2突變的卵巢癌患者，特別是晚期復發的卵巢癌患者往往采取個性化的治療措施[7]。除了手術和化療，臨床上更傾向于口服PARPi藥物作為一線的維持治療或復發后化療達到CR/PR的維持治療。雖然BRCA1/2突變的狀態對卵巢癌的臨床決策和預后很重要，但中國目前尚處在探索階段，需要更多多中心的臨床研究進入臨床實踐。

本研究描述了本中心82例行基因檢測的上皮性卵巢癌患者BRCA突變狀態，與常見的臨床病理因素間的關系以及對預后的影響。在我們的研究中，總突變率為30.48%，其中BRCA1突變率為20.73%，BRCA2突變率為9.75%，與一項卵巢癌患者BRCA突變系統性分析的結果基本符合(BRCA1和BRCA2的基因突變率分別為1.1%～39.7%和0～13.9%[8]，總突變率略高于王登鳳等[9]報道的突變頻率，其中，BRCA1的突變頻率與吳小華教授報道的20.82%相仿[10]。BRCA1/2基因突變類型包括移碼突變、無義突變、錯義突變、同義突變及剪切突變5種類型，對蛋白質的編碼起到重要作用[11]。本研究中BRCA1共檢測到9種移碼突變，4種錯義突變，BRCA2共檢測到3種移碼突變，4種錯義突變。移碼突變和錯義突變均會導致BRCA編碼的蛋白質出現一級結構的改變，進而引起相關編碼蛋白質功能發生改變或失活。根據目前的資料，這些變異會影響BRCA功能從而導致卵巢癌的發生發展。而c.4132delG位點、C.6528C>G位點臨床意義未明，無文獻報道，有待在今后工作中進一步加深研究。

同時，本研究發現BRCA的致病突變組主要的病理類型為漿液性卵巢癌，且大多對鉑敏感，采取新輔助化療的比例更大(表2)。許多學者認為BRCA突變相關的卵巢癌的病理類型大多都是高級別的漿液性卵巢癌。一項研究結果顯示在BRCA突變相關卵巢癌的患者中高級別漿液性癌的比例為60%～83%，而在BRCA1突變的患者中，這個比例更高[12-13]。這與我們的結果相一致。而BRCA突變的卵巢癌患者的鉑敏感性更是得到了廣泛的認可,“合成致死”原理揭示了其內在機制[14]。因此BRCA突變的卵巢癌患者對鉑類化療藥物為基礎的一線化療方案具有更好的反應性和生存獲益。基于上述分析，BRCA突變的卵巢癌大多為高級別漿液性癌，診斷時臨床期別通常較晚，手術難度更大，選擇新輔助化療后行間歇性腫瘤細胞減滅術似乎成為了更為傾向的選擇。

目前大多數學者普遍認為攜帶BRCA突變的卵巢癌患者預后更好，總生存時間和無進展生存時間較長。Helpman等[15]發現，BRCA突變組的OC患者的無進展生存期突變組(46.2個月)較無突變組(37.7個月)顯著延長,還有一些研究得出相似結論[16-17]。而Bu等[18]的研究則提出無進展生存期突變組(14.31個月)較無突變組(13.62個月)無顯著延長(P>0.05)，但3年和5年生存率有顯著差異。在本研究中，BRCA突變組的中位PFS為18.6個月，較無突變組的12.8個月顯著延長。雖然多因素COX回歸分析顯示BRCA突變狀態并非卵巢癌患者PFS的獨立預后因素，但考慮到鉑敏感為卵巢癌患者PFS的獨立預后因素，且本研究的樣本量仍較小，因此我們仍期待在后續的研究中擴大樣本量，進一步探究BRCA突變狀態是否可作為卵巢癌患者PFS的獨立預后因素。

這項研究有幾個局限性。首先由于該研究是基于本中心接受手術的卵巢癌基因檢測報告進行的研究，檢測時間距離隨訪終點時間較近，存在明顯的幸存者偏倚，故本研究無法進行總生存率OS的統計。在后續的研究中，我們在擴大樣本量的過程中，可以增加總生存率的統計。其次，本研究的樣本量較小，仍需要擴大樣本量以及進行更多的臨床和基礎研究揭示其內在機制。

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