利拉魯肽對KKAy小鼠脂代謝及PI3K蛋白表達的影響

呂 娟，陳莉娜，劉偉華，郭未艷（.西安市第一醫院藥劑科，陜西 西安 7000；.西安交通大學醫學部基礎醫學院，陜西 西安7006；.西安市第一醫院兒科，陜西 西安 7000）

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是胰島素分泌和（或）作用缺陷所引起的一種慢性代謝性疾病[1]。中國是世界上糖尿病發病率上升最快的國家之一，目前我國糖尿病的發病率已高達10.9%[2]。肥胖和血脂代謝紊亂是糖尿病常見的并發癥，也是多種疾病發病的重要危險因素[2-3]。因此，肥胖和血脂代謝紊亂防治對于延緩糖尿病進展及其并發癥的發生具有重要意義。

利拉魯肽是胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）類似物的一種，與人GLP-1具有97%的序列同源性[3]。文獻[3-4]報道，GLP-1及其類似物除了具有降糖作用外，還具有減輕體重和改善血脂紊亂的作用，但其分子作用機制目前仍不明確。本研究以自發性糖尿病KKAy小鼠為動物模型，探討利拉魯肽對KKAy小鼠脂代謝及肝臟PI3K蛋白表達的影響，以期為探討利拉魯肽調節脂代謝的作用機制提供藥理學基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性KKAy小鼠12只，體重30 ～ 35 g；雄性C57BL/6J小鼠6只，體重20 ～ 25 g，兩種小鼠均購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物合格證號：SCXK（京）2014-0004。KKAy小鼠給予高脂飼料，C57BL/6J小鼠給予普通小鼠維持飼料。所有小鼠均可自由進食、飲水；室溫控制在20 ～ 25 ℃，相對濕度維持在45% ～ 55%。

1.2 主要試劑與儀器

利拉魯肽注射液（丹麥諾和諾德公司，規格：3 mL∶18 mg，批號EP51548-1）；總膽固醇、甘油三脂試劑盒（南京建成生物工程研究所）；PI3K抗體（英國Abcam公司）；免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；羅氏卓越型血糖儀及血糖試紙（德國Roche Diagnostics GmbH有限公司）；Multiskan FC酶標儀（美國Thermo Fisher公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組及給藥所有小鼠適應性喂養1周后，稱量體重，剪尾采血測定隨機血糖。KKAy小鼠隨機血糖> 16.7 mmol·L-1認為模型成功。12只KKAy小鼠按體重、血糖隨機分為利拉魯肽組、模型組，每組6只，給予高脂飼料喂養；C57BL/6J小鼠6只作為對照組，給予普通飼料喂養。分組時小鼠體重和血糖情況見表1。利拉魯肽組予利拉魯肽注射液（250 μg·kg-1，ih），對照組和模型組小鼠皮下注射等量的生理鹽水，各組小鼠每天給藥1次，持續給藥6周。末次給藥后稱重小鼠并放入代謝籠，測定進食及飲水量。實驗結束后，稱重小鼠，眼眶采血，離心（3000 r·min-1，10 min）取上清液，血清保存至-80 ℃冰箱備測。采血完畢后，分離肝臟，將所取肝臟組織稱重后固定在10%甲醛溶液中保存備測。

1.3.2 指標檢測①代謝籠實驗：小鼠給藥后稱重放入代謝籠，給予定量的飼料和水，24 h后從代謝籠中取出小鼠，測定剩余飼料和水的量，計算小鼠24 h進食量及飲水量。②肝臟指數[5]：肝臟指數=肝臟重量/小鼠體重×100%。③總膽固醇（total cholesterol，TC）及甘油三酯（triglyceride，TG）檢測：按照試劑盒說明書檢測。④HE染色切片：從甲醛固定液中取出肝臟組織，石蠟包埋后常規切片，HE染色、封片，光鏡下觀察肝臟組織病理變化。⑤肝臟組織中PI3K的表達：肝臟組織石蠟包埋后切片，山羊血清封閉，一抗、二抗孵育，DAB顯色，中型樹膠封片，光鏡下觀察，拍照，對結果進行統計分析。

1.4 統計學方法

數據采用SPSS 17.0軟件統計分析，計量資料以均值±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗，P< 0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 利拉魯肽對KKAy小鼠進食、飲水量的影響

給藥后，與對照組相比，模型組和利拉魯肽組小鼠的進食及飲水量明顯增加（P< 0.05）；與模型組相比，利拉魯肽組小鼠的飲水量明顯減少（P< 0.05），進食量雖有減少但差異無統計學意義（P> 0.05）。見表2。

2.2 利拉魯肽對KKAy小鼠肝臟重量及肝臟指數的影響

給藥后，與對照組相比，模型組和利拉魯肽組小鼠的肝臟重量及肝臟指數顯著增加（P< 0.05）；與模型組相比，利拉魯肽組小鼠的肝臟重量及肝臟指數明顯下降，差異均具有統計學意義（P< 0.05）。結果表明利拉魯肽可減少KKAy小鼠肝臟脂肪沉積。見表3。

2.3 利拉魯肽對KKAy小鼠血清中TC及TG的影響

給藥后，與對照組相比，模型組和利拉魯肽組小鼠的血清TC和TG含量顯著增加（P< 0.05）；與模型組相比，利拉魯肽組TC和TG含量雖有下降趨勢但差異無統計學意義（P> 0.05）。見表4。

2.4 利拉魯肽對KKAy小鼠肝臟組織形態的影響

HE結果顯示，與對照組相比，模型組肝細胞腫脹、空泡樣變（主要為脂肪變性），以小葉周邊部最明顯。與模型組相比，利拉魯肽組肝細胞腫脹程度減輕，空泡樣變減少，細胞核增多，炎癥減輕。結果表明，利拉魯肽可以減輕KKAy小鼠肝臟損傷。

2.5 利拉魯肽對KKAy小鼠肝臟PI3K蛋白表達的影響

免疫組化結果顯示，與對照組相比，模型組和利拉魯肽組小鼠肝臟PI3K蛋白表達明顯降低，差異具有統計學意義（P< 0.05）；與模型組相比，利拉魯肽組PI3K蛋白表達顯著增加（P< 0.05）。結果表明利拉魯肽可提高KKAy小鼠肝臟組織PI3K蛋白的表達。見表5。

表5 利拉魯肽對KKAy小鼠肝臟PI3K蛋白表達的影響. n = 6Tab 5 Effects of liraglutide on the expression of PI3K protein in liver tissue of KKAy mice. n = 6

3 討論

利拉魯肽注射液于2009年在歐盟首次上市，以濃度依賴形式促進胰島素分泌，并可通過調節機體分泌胃泌素及胰高血糖素來發揮降糖作用[4,6]。有研究[7]表明，GLP-1可通過增加飽腹感和減少饑餓感來減少能量攝入，從而達到減重的目的。本課題組前期研究發現，利拉魯肽可減輕KKAy小鼠體重，改善其胰島素抵抗狀態[8]。在本研究中，研究者運用代謝籠實驗驗證了利拉魯肽對KKAy小鼠進食及飲水情況的影響，結果提示利拉魯肽可減少KKAy小鼠的進食及飲水量。

肝臟是糖脂代謝的重要器官，脂代謝紊亂可導致脂肪在肝細胞內異常沉積從而誘發肝臟損傷[9-10]。肝臟重量和肝臟指數是衡量脂肪在肝臟沉積的重要指標[11]。本研究結果顯示，KKAy小鼠的肝臟重量與肝臟指數較對照組明顯增加，但經過利拉魯肽干預后，KKAy小鼠的肝臟重量和肝臟指數顯著下降。肝臟組織病理形態學結果顯示，干預后小鼠肝臟細胞腫脹和脂肪變性有所減輕。結果證實利拉魯肽可減少脂肪在肝臟的沉積，減輕肝臟損傷。

TC和TG含量異常變化是脂代謝紊亂的重要標志，也是多種心腦血管疾病的危險因素[12]。在胰島素抵抗狀態下，外周組織對葡萄糖的利用能力下降，脂肪分解加速產生大量的游離脂肪酸，過量的游離脂肪酸經循環系統進入肝臟合成膽固醇和甘油三酯[13]。本研究結果顯示，KKAy小鼠血清TC和TG水平明顯升高，證明存在脂代謝紊亂，使用利拉魯肽干預后，KKAy小鼠血清TC和TG水平雖有下降趨勢但差異無統計學意義。提示利拉魯肽可在一定程度上緩解糖尿病脂代謝紊亂。

PI3K家族屬于原癌基因，由Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類PI3K三個家族成員組成，其中主要起作用的是Ⅰ類PI3K，它是由一個p110（110 kd）催化亞基和一個p85（85 kd）調節亞基組成的異源二聚體，具有脂類激酶活性和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性，磷酸化后的PI3K可激活其下游的eNOS、GSK、GLUT4等多種底物受體，產生生物學效應[14-17]。有研究指出脂代謝紊亂和PI3K蛋白表達異常有著密切的關系[18]。本研究中，模型組KKAy小鼠肝臟組織PI3K蛋白的表達較對照組小鼠明顯減少，經過利拉魯肽干預后，肝臟組織PI3K蛋白表達量顯著增加，表明利拉魯肽可通過上調PI3K蛋白的表達來調節KKAy小鼠脂代謝紊亂狀況。

綜上，利拉魯肽可在一定程度上降低KKAy小鼠進食量、TC及TG水平；顯著減少KKAy小鼠飲水量；上調肝臟PI3K蛋白的表達；改善KKAy小鼠肝臟損傷狀況。結果表明，利拉魯肽可以改善脂代謝紊亂狀況，其機制可能與肝臟組織PI3K蛋白的表達增加有關，但更明確的作用機制仍需要深入研究來探討，為利拉魯肽在糖尿病伴發脂代謝紊亂的臨床應用提供藥理學依據。