酵母水解物對吉富羅非魚生長、免疫力、抗氧化性及抗無乳鏈球菌感染的影響*

董蘭芳 張彩群 劉家輝 鄭曉利 童 潼 ①張 琴 王秀華 楊慧贊

(1. 廣西民族大學海洋與生物技術學院 廣西多糖材料與改性重點實驗室 廣西高校微生物與植物資源利用重點實驗室 廣西 南寧 530006；2. 廣西海洋研究所有限責任公司 廣西 北海 536000；3. 中國水產科學研究院黃海水產研究所 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室農業農村部海水養殖病害防治重點實驗室 青島市海水養殖流行病學與生物安保重點實驗室 山東 青島 266071；4. 廣西水產科學研究院 廣西水產遺傳育種與健康養殖重點實驗室 廣西 南寧 530021)

酵母水解物也稱復合酵母，作為一種新型的優質單細胞蛋白原料，是用內源酶及外源酶水解純培養酵母而獲得的酵母自溶物，富含大量核酸、各類核苷酸、游離氨基酸、小肽及B族維生素，同時含有一定量的細胞壁多糖，是一種新型的功能性蛋白原料(楊凡等,2016)。酵母水解物中游離氨基酸占總蛋白比例在70%以上，細胞壁多糖水解生成的葡聚糖和甘露寡糖為17%～30%，核酸含量為15%以上(聶琴等, 2014)。諸多研究表明，酵母水解物中各類營養性功能物質對養殖動物的生長、免疫力等有積極促進作用。酵母水解物能夠解決母豬便秘，提高其幼崽成活率，促進泌乳；能夠提高育肥豬的生長和飼料利用，顯著提高階段性營養物質的表觀消化率；能夠增加幼齡豬進食量，降低腹瀉率，提高免疫力，從而促進其生長；適度酶解后，水解物中的功能小肽和游離的氨基酸還能促進豬仔進食(伏潤奇等, 2019; 周慧琦等, 2015)。酵母水解物富含大量核酸，而核酸能夠調節禽類胃腸道微生物菌群，抑制有害微生物繁殖，促進禽類生長，提高出欄質量，降低料肉比(賀淼等, 2015)。在水產動物方面，學者們研究了飼料添加酵母水解物或部分替代飼料中魚粉對異育銀鯽(Carassius auratus gibelio) (楊 凡 等 , 2015)、 大 菱 鲆 (Scophthalmus maximus) (柳茜等, 2015)和凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei) (熊家等, 2017)等水產動物的影響。

吉富羅非魚(Oreochromis niloticus)是我國重要的羅非魚養殖品種，具有生長快、規格齊、抗病力強等特點。其養殖管理簡單，起捕率高，投資見效快，在廣東、廣西和海南等地已大規模人工養殖，有關在吉富羅非魚生長過程中添加促生長劑或免疫增強劑的研究較多(湯菊芬等, 2016; 王壇等, 2019)，但飼料添加酵母水解物對吉富羅非魚的影響未見研究報道。本研究旨在探究酵母水解物對吉富羅非魚生長性能、免疫力、抗氧化能力及抗無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)感染的影響，為酵母水解物在羅非魚養殖生產中的應用提供基礎數據和理論指導。

1 材料與方法

1.1 飼料配方與制作

參照羅非魚的營養需要(National Research Council ,1993)并結合國內實際生產情況設計飼料配方，以豆粕和菜籽粕為主要蛋白源，魚油和大豆卵磷脂為主要脂肪源，配制成粗蛋白為34.28%、粗脂肪為4.69%的基礎飼料，基礎飼料配方及營養組成見表1。所有原料粉碎后過60目篩片，按配方將各原料按比例稱重，先將粉狀原料混合均勻，再加入卵磷脂和魚油后混勻，之后加水制成濕面團，將濕面團分成小碎塊后烘干、粉碎，稱取5份等質量飼料，按0、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%的比例添加酵母水解物(酵母水解物由湖北安琪酵母有限公司友情提供)，分別混勻后加水重新制成濕面團，面團用實驗室單螺桿膨化機將飼料制成2.0 mm×3.0 mm的顆粒，飼料調質溫度控制在90℃～ 100℃。飼料顆粒于室內陰涼處風干后，保存在-20℃冰箱中備用。共制成5種實驗飼料，分別記為對照組、Y0.5%、Y1.0%、Y1.5%和Y2.0%實驗組，5種飼料的蛋白含量實測值分別為34.28%、34.31%、34.38%、34.42%和34.51%。

表1 基礎飼料配方(%干物質)Tab.1 Composition of the basal diets (% of dry matter)

1.2 實驗動物養殖管理

吉富羅非魚由國家級廣西南寧羅非魚良種場提供。實驗在廣西民族大學水產養殖多功能實驗室進行，羅非魚先在3 m3的白色大塑料桶內暫養1周，暫養期間飼喂基礎飼料。暫養結束后，挑選規格均一、活力好的羅非魚 450尾 [初始體重為(25.80±0.45) g]，隨機分成5組，每組3個重復，每個重復30尾魚。魚苗隨機分配到室內淡水循環系統中的15個容積為150 L的玻璃缸中。養殖實驗持續8周，5個實驗組分別飼喂 5種實驗飼料，每日按魚體質量的2%～5%投喂，根據每天各組羅非魚的實際攝食情況進行適當調整，每天投喂2次，投喂時間為08:00和17:00，每次投喂后2 h內吸除殘餌和糞便，每天換水1/3。飼養期間連續充氣，水溫為28℃～31℃，pH為7.2～7.6，氨氮含量不超過0.05 mg/L，溶解氧含量不低于5 mg/L。

1.3 樣品的采集與處理

8周飼養實驗結束，停食24 h后，從每缸中隨機取 5尾魚，用注射器從羅非魚尾靜脈采血，置于Eppendorf管中，4℃靜置 1 h 后，4℃ 6000 r/min 離心10 min，取血清置于-80℃冰箱備用。剩余的魚進行稱重，計算羅非魚的特定生長率(specific growth rate,SGR)，計算公式如下：

特定生長率(SGR, %/d)=100 × (lnWt-lnW0)/t

式中，W0和Wt分別為平均初始體質量(initial body weight, IBW)和平均終末體質量(final body weight,FBW)，t為實驗天數。

1.4 免疫指標的測定

血清一氧化氮合酶(NOS)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、酸性磷酸酶(ACP)活性采用南京建成生物工程研究所研制的試劑盒測定。

血清酚氧化酶(PO)活性的測定：參考曹俊明等(2011)的方法略作改動，以L-DOPA為底物，把10 μL血清加入96孔酶標板中，然后向各孔中加入200 μL濃度為0.1 mol/L、pH為7.0的磷酸鹽緩沖液，最后向各樣品孔中加入10 μL濃度為0.01 mol/L的L-DOPA，室溫下溫育10 min后，立刻放入酶標儀中，在490 nm下測定酶活動力學。以實驗條件下每毫升樣品每分鐘OD490 nm增加0.001定義為1個酶活力單位。

血清蛋白濃度測定：采用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度(Bradford, 1976)，以牛血清蛋白為標準。

1.5 無乳鏈球菌攻毒實驗

養殖結束后，進行無乳鏈球菌攻毒實驗。攻毒所用無乳鏈球菌菌種由廣西海洋生物技術重點實驗室提供。每個重復選擇羅非魚12尾進行攻毒實驗，每尾魚腹腔注射 0.2 mL濃度為 8.3×105CFU/mL的菌液。連續觀察14 d，統計累積死亡率(accumulative mortality rate, AMR)。

1.6 數據的統計分析

采用SPSS 19.0軟件對實驗結果進行統計分析，數據采用平均值±標準誤(Mean±SE) (n=3)表示，若差異達到顯著(P＜0.05)，則用Tukey多重比較分析各組數據之間的差異。

2 結果與分析

2.1 酵母水解物對吉富羅非魚生長的影響

由表2可知，各處理組間FBW和SGR存在顯著差異(P＜0.05)，隨著酵母水解物添加量的增加，FBW和SGR均呈先上升后下降的趨勢，并在Y1.5%組達到最大值。雖然各組成活率無顯著差異(P＞0.05)，但添加酵母水解物實驗組稍高于對照組。吉富羅非魚SGR和飼料酵母水解物添加量的二次曲線回歸方程為y=-0.252 4x2+0.653 4x+1.572 5 (R2=0.957 7)，當 SGR 達到最大值時，對應的酵母水解物添加量為1.29%。

表2 飼料中添加酵母水解物對吉富羅非魚生長的影響(平均值±標準誤, n=3)Tab.2 Effect of yeast hydrolysate on the growth of GIFT tilapia (Means±SE, n=3)

2.2 酵母水解物對吉富羅非魚血清非特異性免疫酶活性的影響

由表3可知，隨著飼料中酵母水解物添加量的提高，羅非魚血清NOS、PO和ACP活性均呈現不同程度先上升后下降的趨勢，且均在Y1.5%組達到最大值(P＜0.05)。

表3 飼料中添加酵母水解物對吉富羅非魚血清非特異性免疫酶活性的影響(平均值±標準誤)Tab.3 Effects of yeast hydrolysate on nonspecific immune enzyme activities of GIFT tilapia (Mean±SE)

2.3 酵母水解物對吉富羅非魚血清抗氧化酶活性的影響

由表4可知，與非特異性免疫酶相同，羅非魚血清CAT和SOD活性也隨飼料中酵母水解物添加量的提高呈現不同程度先上升后下降的趨勢，且均在Y1.5%組達到最大值(P＜0.05)。

表4 飼料中添加酵母水解物對吉富羅非魚血清抗氧化酶活性的影響(平均值±標準誤)Tab.4 Effects of yeast hydrolysate on antioxidant enzyme activities of GIFT tilapia (Mean±SE)

圖1 吉富羅非魚SGR與飼料酵母水解物添加水平的回歸分析Fig.1 Regression analysis between SGR of GIFT tilapia and yeast hydrolysate level

2.4 飼料添加酵母水解物對吉富羅非魚抗無乳鏈球菌感染能力的影響

由表5可知，飼料添加酵母水解物對吉富羅非魚抗無乳鏈球菌感染的能力產生顯著影響(P＜0.05)，除Y0.5%實驗組外，其他實驗組(酵母水解物添加1.0%及以上)羅非魚的死亡率均顯著低于對照組(P＜0.05)，說明酵母水解物能顯著提高吉富羅非魚對無乳鏈球菌的抵抗力。

表5 飼料中添加酵母水解物對吉富羅非魚抗無乳鏈球菌感染能力的影響(平均值±標準誤)Tab.5 Effects of yeast hydrolysate on disease resistance to S. agalactiae of GIFT tilapia (Mean±SE)

3 討論

3.1 酵母水解物對吉富羅非魚生長性能的影響

酵母水解物對養殖動物影響的研究主要集中于陸生動物，它能夠提高雞、豬、牛等的生長性能和免疫力(付潤奇等, 2019; 周慧琦等, 2015; 賀淼等, 2015;Oeztuerket al, 2016; 李建明等, 2015)。近年來，在水產動物中應用的研究也越來越廣泛。研究表明，酵母水解物能顯著提高加州鱸(Micropterus salmoides)的生長速度和飼料蛋白質效率，提高其飼料利用率，且加州鱸生長性能最優時酵母水解物的適宜添加量為1.51%～1.69% (曾本和等, 2016)。凡納濱對蝦的增重率、特定生長率和蛋白質效率也隨酵母水解物添加量的增加而增加，酵母水解物添加量為5%的對蝦的生長性能顯著高于對照組(熊家等, 2018)。隨著酵母水解物添加量的增加，草魚(Ctenopharyngodon idellus)的增重率、特定生長率和蛋白質效率均呈先降低后升高再降低的趨勢，添加量為1.5%～1.7%時獲得最佳生長性能(曾本和等, 2015)。也有研究表明，酵母水解物對某些養殖品種的生長率沒有顯著影響，如添加0.5%酵母水解物飼料對大口黑鱸(Micropterus salmoides)的生長無顯著影響(時博等, 2018)。飼料添加0.1%、0.2%、0.3%酵母水解物，齊口裂腹魚(Schizotheorax prenanti)的生長性能無顯著變化(楊軍等, 2019)。添加0.5%、1%、2%酵母水解物，凡納濱對蝦的成活率、增重率與對照組相比，差異不顯著(遲淑艷等, 2016)。這可能跟養殖品種的敏感性以及同一品種酵母水解物添加方式和添加量不同有關，5%酵母水解物能顯著改善凡納濱對蝦的生長性能，而0.5%～2%添加量對其無顯著影響(熊家等, 2018; 遲淑艷等, 2016)。有關酵母產品對羅非魚生長的研究已有報道，高桂平等(2018)研究表明，飼料添加酵母、酵母RNA、酵母RNA+β-葡聚糖復合物均能提高吉富羅非魚幼魚的生長性能，且單獨添加0.04%酵母RNA對幼魚的促生長效果最好；尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)生長率隨飼料海洋紅酵母(Rhodotorula mucilaginosa)添加量的增加呈先增加后降低的趨勢(楊鏗等, 2016)。與上述研究結果類似，本研究中吉富羅非魚的生長性能隨著酵母水解物添加量的增加而顯著提高，添加量為1.5%時，SGR達到最大值；繼續加大酵母水解物的添加量，吉富羅非魚的生長率沒有繼續提高，反而有一定降低。酵母水解物富含天然核苷酸、小肽、游離氨基酸、葡聚糖、甘露寡糖和B族維生素等營養功能性物質，能補充養殖動物快速生長時期內源核苷酸合成的不足，修復腸道，改善肝功能，促進生長發育(楊凡等, 2016; 聶琴等, 2014)。然而，過多的核苷酸可能對肝臟的脫嘌呤過程造成負擔(劉瑩等, 2016)，這可能是高酵母水解物添加量實驗組吉富羅非魚生長率有所降低的原因。另外，王永宏等(2013)研究表明，連續投喂β-葡聚糖會使動物機體長期處于免疫激活狀態，造成營養物質重分配進而對生長性能造成負面影響。回歸分析表明，本實驗條件下，吉富羅非魚酵母水解物的最適添加量為1.29%。

3.2 酵母水解物對吉富羅非魚血清免疫酶和抗氧化酶活性的影響

本研究中，吉富羅非魚的免疫酶(NOS、PO和ACP)和抗氧化酶(CAT和SOD)活性均隨飼料中酵母水解物添加量的增加而顯著提高，在添加量為1.5%時達到最大值，而后出現一定的降低，這與生長率變化趨勢一致。酵母水解物富含特有的核苷酸、葡聚糖和甘露寡糖等功能性成分，可能是提高吉富羅非魚免疫力和抗氧化能力的原因。核苷酸是生物體內遺傳物質的基本單位，也是蛋白質合成必需的中間體，在細胞結構、代謝、能量和功能調節等方面具有重要作用(許群等, 2004)。研究表明，飼料添加外源核苷酸能顯著提高凡納濱對蝦堿性磷酸酶活力和總抗氧化能力(許丹丹等, 2011)，也能顯著提高鰓中PO及血清和肝胰臟中溶菌酶(LZM)活性(曹俊明等, 2011)；酵母核苷酸添加組鯉魚的血清LZM、SOD和CAT活性顯著升高(向梟等, 2011)；外源核苷酸也能顯著提高奧尼羅非魚肝臟內SOD和CAT活力(韓春艷等, 2018)。而β-葡聚糖作為一種新型的天然免疫增強劑，通常以β-1,3-糖苷鍵為主鏈，以β-1,6-糖苷鍵為支鏈，其特殊的鍵連接方式和分子內氫鍵的存在造成螺旋型的分子結構，很容易被免疫系統接受，可以提高魚類的免疫力(杜建等, 2018; Misraet al, 2006; Aiet al, 2007)。高桂平等(2018)研究證實，β-葡聚糖可提高吉富羅非魚血漿中SOD、CAT、LZM和ACP活力。另外，酵母水解物富含B族維生素，B族維生素通過提高血清LZM和ACP以及總鐵結合力增強魚類殺菌和抑菌能力，進而增強魚類非特異性免疫力。因此，酵母水解物能顯著提高吉富羅非魚的免疫力和抗氧化力，但過量添加酵母水解物并不能強化已處于正常狀態的免疫系統。

3.3 酵母水解物對吉富羅非魚抗無乳鏈球菌感染能力的影響

羅非魚是無乳鏈球菌最敏感的宿主，無乳鏈球菌給羅非魚產業帶來巨大的經濟損失(蘇友祿等, 2019)。研究表明，魚類對疾病的抵抗力存在著物種間和個體間的差異，具有良好免疫力的羅非魚更能抵御無乳鏈球菌的侵染。朱佳杰等(2015)評估了不同品系羅非魚抗無乳鏈球菌病的性能，從感染死亡率來看，奧尼羅非魚的抗病性能優于其他品系，吉富羅非魚的感染死亡率最高；飼喂添加植物提取物(樟樹皮、平喘草、印楝葉及木瓜種子)飼料的尼羅羅非魚的免疫力顯著高于對照組，無乳鏈球菌的患病率也顯著低于對照組(Kareem et al, 2016)。張永政(2017)研究顯示，飼料中添加黃柏(Phellodendron amurense)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和磺胺嘧啶都能不同程度地提高羅非魚非特異性免疫指標和抗無乳鏈球菌感染能力。本研究中酵母水解物能顯著提高吉富羅非魚的免疫能力和抗氧化能力，從而表現出良好的無乳鏈球菌免疫保護作用，顯著降低了無乳鏈球菌感染的累積死亡率，且累積死亡率的降低程度與免疫酶和抗氧化酶活性的提高程度呈正相關，添加量為1.5%實驗組的累積死亡率最低。

4 結論

本研究證明，飼料添加酵母水解物可有效提高吉富羅非魚生長性能、免疫力及抗病力，添加量為1.5%時，效果最顯著。酵母水解物作為促生長劑和免疫增強劑，在提高吉富羅非魚生長性能和抗病能力方面有重要意義。