鉤薄過敏顆粒對CVA 大鼠肺組織基質金屬蛋白酶9 及其抑制劑1 表達的影響*

劉振志，翟慧媛，袁亮亮，于 雷，盧 寧

1 南京中醫藥大學附屬南京市中西醫結合醫院 藥學部，南京 210014；2 江蘇第二師范學院，南京 210013；3 南京市中心醫院，南京 210018

咳嗽變異性哮喘（cough variant asthma，CVA）于1972 年由Glauser 首次報道[1]，又名隱匿性哮喘、過敏性咳嗽。臨床主要癥狀為慢性咳嗽，無明顯喘息、氣促等癥狀；但有氣道高反應性和氣道炎癥，與哮喘類似。近年來，CVA 的發病率呈持續上升趨勢，嚴重威脅公眾健康，在我國CVA 占兒童慢性咳嗽比例高達41.95%[2]，約30%的患兒最終進展為支氣管哮喘。在2002 年的《全球哮喘處理和預防策略》（GINA）上，提出它是支氣管哮喘的一種特殊形式，多數學者認為，CVA 的發病機制與支氣管哮喘大致相同，主要為慢性非特異性氣道炎癥和氣道重塑[3]。

研究表明，基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）可降解肺組織細胞外基質和基底膜，且能調節蛋白酶和細胞因子的活性，在支氣管哮喘氣道重塑的病理過程中發揮著重要作用。基質金屬蛋白酶抑制劑-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）是MMP-9 的生理性抑制劑，其反應性的升高可導致膠原沉積，進一步引起氣道重塑[3]。本研究通過檢測大鼠肺組織MMP-9 和TIMP-1 mRNA 表達，進而探究鉤薄過敏顆粒對咳嗽變異性哮喘大鼠氣道重塑的影響，更深入的闡述該品治療咳嗽變異性哮喘可能的作用機制。

1 材 料

1.1 藥品和試劑

鉤薄過敏顆粒由鉤藤、薄荷、桔梗、魚腥草、炙甘草、黃芪等配方顆粒組成（批號19041291，顆粒劑均采自江陰天江藥業有限公司），生理鹽水配制成1.342、2.863 g·mL-1的混懸液備用；醋酸地塞米松片（浙江仙琚制藥有限公司，5 mg/片，批號180687），生理鹽水配制成0.05 mg·mL-1的溶液備用。

卵蛋白（OVA）、氫氧化鋁（中國阿拉丁公司）；TIMP-1 抗體、MMP-9 抗體（Proteintech 公司）；βactin（Abcam 公司）；TRIzol（1596-026）（Invitrogen 公司）；SYBR Green PCR 試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒（均為Thermo 公司）；水為重蒸水。

1.2 實驗儀器

Multiskan MK3 酶標儀（Thermo 公司）；Realtime 檢測儀（Bio-Rad 公司）；DYY-6C 型電泳儀（北京六一儀器廠）；420AI 超聲霧化器（江蘇魚躍醫療設備股份有限公司）；Sartorius B71250 電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；凝膠成像分析系統（Bio-Rad 公司）。

1.3 實驗動物

SPF 級健康SD 大鼠，雄性，30 只，6 周齡，體重180～240 g（上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供），生產許可證號為SCXK（滬）2018-0006，實驗動物使用許可證號為SYXK（蘇）2017-0015。

1.4 引物

RT-PCR 引物由上海生工生物技術有限公司合成。TIMP-1 擴增片段大小為482bp，上游引物：5’-TGCAACTCGGACCTGGTTAT-3’，下游引物：5’-GGTTCTGGGACTTGTGGACA-3’；TIMP-1 擴增片段大小為496bp，上游引物：5’-TGCGCTGGGCTTAGATCATT-3’；下游引物：5’-TGCAGTGGGACACATAGTGG-3’；β-actin 擴增片段大小為287bp，上游引物：5’-ATCGTAAAGACC TCTATGC-3’；下游引物：5’-AACGCAGCTCA GTAACAGTC-3’。

2 方 法

2.1 動物模型建立、分組及給藥

將30 只雄性SD 大鼠按照體重隨機等分為5組，分別為：正常組、模型組、地塞米松（0.5 mg·kg-1）組、鉤薄過敏顆粒低、高劑量組（13.42、28.63 g·kg-1），每組6 只。除正常組外，其他組均按照以下方法造模：新配制的10%OVA 和Al（OH）3混合液1 mL 皮下注射致敏。注射方法為：每只大鼠取兩后足跖、腹股溝部、腰部、背部和頸部共10 點，每點皮下注射0.05 mL，同時腹腔注射0.5 mL，共計1 mL；1 周后重復1 次加強致敏。造模第15 天起，隔日上午霧化吸入：將大鼠置于密閉的有機玻璃罩中，用超聲霧化儀在400 mmHg 恒壓下噴入1% OVA 溶液20 min，激發哮喘。以大鼠腹肌明顯收縮為陽性，直到出現呼吸加深、加快、口鼻分泌物增多、劇烈嗆咳等呼吸道痙攣癥狀，提示造模成功。

空白組以生理鹽水替代OVA。各組于第15 天開始給藥，連續13 天，通過灌胃給藥（1 mL/100 g）。正常組和模型組給予同體積重蒸水。

2.2 動物處置及標本制備

大鼠于第28 天末次給藥后，禁食不禁水12 h，腹腔注射10%水合氯醛（0.33 mL/100 g）進行麻醉，處死動物。留取肺組織：打開胸腔，結扎左側肺門，切取大鼠左肺上葉組織，置于凍存管內，隨后迅速移入-80 ℃液氮中凍存，以進行RT-PCR 檢測mRNA 表達；切取左肺下葉組織放入凍存管，隨后迅速置于液氮中保存，以進行Western-blot 檢測相關蛋白表達。

2.3 實時定量PCR 檢測肺組織中TIMP-1 mRNA、MMP-9 mRNA 水平

①用TRIzol 法提取組織總RNA：稱取50～100 mg 組織，置于研缽中，加入少許液氮迅速研磨，研磨至粉末狀；轉移至無酶的1.5 mL 離心管中，加入1 mL TRIzol 劇烈振蕩，室溫裂解10 min；12 000 r·min-1離心5 min，棄沉淀，上清液加入總體積1/5 氯仿，渦旋振蕩15 s，室溫靜置10 min，12 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液于新的無酶1.5 mL 離心管中；加入等體積異丙醇，上下顛倒8～10 次，靜置10 min，12 000 r·min-1離心10 min，棄上清液；每管加入1 mL 焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水配制的75%乙醇，溫和振蕩懸浮沉淀，7500 r·min-1離心10 min，棄上清液，晾至半透明；加入50～100 μL DEPC 水溶解沉淀，待充分溶解后以熒光分光光度計檢測RNA 濃度。②RNA 逆轉錄為cDNA：在200 μL離心管中分別加入dNTP Mixture（各10 mmol·L-1），Oligodt 引物（2.5 μmol·L-1），總RNA（1 μg），RNAse Free ddH2O 補至總體積20 μL。在PCR 儀上進行逆轉錄反應，37 ℃15 min（反轉錄反應），85 ℃5 s（反轉錄酶的失活反應）。③SYBRGreen 法進行實時熒光定量PCR：按照下述比例在冰上配制SYBRGreen（5X）10 μL，引物F（10 μmol·L-1）1 μL，引物R（10 μmol·L-1）1μL，上述cDNA 1μL，dd H2O 補至總體積20μL，上機進行實時熒光定量PCR 反應。擴增條件為：95℃3min 預變性后，95℃15s 變性，60℃60s 退火、72℃60 s 延伸，共循環40 次。④數據計算：ΔCt=Ct目的基因-Ct內參基因，用2-ΔCt表示某樣本某基因表達水平，2-ΔΔCT計算基因表達的相對比值。

2.4 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測CVA 大鼠肺組織中TIMP-1、MMP-9 蛋白的表達

①樣品準備：稱取50～100 mg 大鼠肺組織，少許液氮迅速研磨至粉末狀；轉移至1.5 mL EP 管中，加入600 μL 含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液，40 V 冰上超聲30s，冰上裂解20min，4℃下12000r·min-1離心20 min，小心吸取上清液；Bradford 法測定蛋白濃度，酶標儀上檢測蛋白濃度；加入5×SDS，95 ℃金屬浴10 min 變性蛋白，1×SDS 調至相同蛋白濃度備用。②Western blot：SDS-PAGE 膠配制，分離膠濃度10%；每孔上樣量20 μg，體積15～20 μL，80 V 電泳至濃縮膠結束，樣品進入分離膠時間約30 min，分離膠120 V，60～90 min；將樣品從SDS-PAGE 膠轉移至PVDF 膜上，冰上100 V，60 min；配制5%脫脂奶粉放入轉膜后的PVDF 膜，室溫下于脫色搖床上60 min；一抗孵育：加入一抗4 ℃過夜；1×TBST，脫色搖床上10 min/次，重復3 次；二抗孵育：加入二抗室溫孵育60 min；洗膜：1×TBST，脫色搖床上10 min/次，重復3 次；顯色：配制化學發光顯色液，A∶B=1∶1，置于自動電泳凝膠成像分析儀曝光，Image J 軟件灰度掃描分析。

2.5 統計學處理

采用SPSS17.0 統計學軟件處理。各組實驗數據以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠肺組織TIMP-1、MMP-9mRNA 表達的比較

與正常組相比，模型組大鼠肺組織中MMP-9和TIMP-1 的mRNA 水平明顯升高（P＜0.01），與模型組相比，鉤薄過敏顆粒高劑量組MMP-9 和TIMP-1 的mRNA 水平顯著降低（P＜0.01），說明鉤薄過敏顆粒能夠抑制OVA 模型組肺組織MMP-9和TIMP-1 的表達。見表1。

表1 鉤薄過敏顆粒對TIMP-1 和MMP-9mRNA 表達水平的影響（±s，n=6）

表1 鉤薄過敏顆粒對TIMP-1 和MMP-9mRNA 表達水平的影響（±s，n=6）

3.2 各組大鼠肺組織TIMP-1、MMP-9 蛋白表達的比較

Western-blot 法檢測各組大鼠肺組織中TIMP-1 和MMP-9 蛋白表達水平，顯影結果見圖1。

圖1 各組肺組織TIMP-1、MMP-9 蛋白表達結果

用Image J 軟件對圖片進行灰度掃描，記錄蛋白表達水平（以測定蛋白/β-actin 灰度值計），并進行組間比較，結果見表2。

表2 鉤薄過敏顆粒對TIMP-1 和MMP-9 蛋白表達水平的影響（±s，n=6）

表2 鉤薄過敏顆粒對TIMP-1 和MMP-9 蛋白表達水平的影響（±s，n=6）

與正常組相比，模型組大鼠肺組織中TIMP-1和MMP-9 表達明顯增多（P＜0.01），而與模型組相比，鉤薄過敏顆粒低劑量組TIMP-1 蛋白表達無差異（P＞0.05），MMP-9 蛋白表達明顯減少（P＜0.01），地塞米松組和鉤薄過敏顆粒高劑量組TIMP-1 和MMP-9 表達降低（P＜0.01），有統計學顯著意義，說明鉤薄過敏顆粒能夠抑制CVA 大鼠肺組織中TIMP-1 和MMP-9 蛋白的表達。

4 討論

課題組前期研究已證實，鉤薄過敏顆粒治療CVA 臨床療效確切，并觀察到該品可以減少動物模型肺組織的炎性浸潤以及通過調控炎癥因子水平而減輕氣道炎癥[4，5]。鉤薄過敏顆粒以鉤薄過敏煎湯（以下簡稱“過敏煎”）（五味子、烏梅、銀柴胡、防風）為基礎，具體有鉤藤、薄荷、銀柴胡、防風、黃芪、桔梗、魚腥草、虎杖、生甘草、紫菀、烏梅、馬鞭草、款冬花等13 味中藥組成，鉤藤、薄荷為常用對藥，鉤藤息風、解痙，薄荷解郁利咽，兩者配合可清熱解痙、利咽止咳；銀柴胡、黃芪、防風、烏梅、甘草在臨床中有較強的抗變態反應作用，具有祛風止癢、解痙止咳之功，其中用黃芪代替過敏煎中五味子，取其補益肺氣、增強機體免疫力；魚腥草、虎杖、馬鞭草是臨床常用止咳對藥，有清熱、利咽、止咳、活血之功；桔梗、紫苑止咳化痰。全方“祛風論治”，疏肝泄熱、熄風止痙[6]。

現代醫學發現，在CVA 的發病過程中，慢性的氣道炎癥會引起氣道壁局部組織的損傷，而氣道重塑的最初原因是機體因為氣道炎癥所產生的反應性修復，修復與損失的失調最終會起到重塑的發生。細胞外基質（ECM）在氣道壁的過多沉積是引起重塑的主要原因之一，也是CVA 的重要病理機制之一。基質金屬蛋白酶-9 是調節ECM 代謝的主要限速酶。在CVA 發作期，MMP-9 升高，基底膜的完整性遭到破壞，大量炎性細胞浸潤氣道壁，導致氣道炎癥反應及氣道高反應性。MMP-9 還可黏附IL-8，并加強IL-8 作為中性粒細胞趨化因子的活性，活性加強后IL-8 的趨化作用至少高于正常的10 倍，因此肺組織中的MMP-9 水平與其炎癥反應的嚴重程度及ECM 沉積的嚴重程度密切相關。此外，MMP-9 的持續性升高促進其抑制因子基質金屬蛋白酶抑制劑-1 反應性升高，抑制膠原分解，導致膠原沉積。細胞外基質成分在氣道壁的過多沉積可引起氣道壁的纖維化和氣流受阻，導致氣道重塑的發生[6，7]。

本研究顯示，CVA 大鼠模型組肺組織的TIMP-1、MMP-9 mRNA 和蛋白的表達顯著增加，提示TIMP-1、MMP-9 參與了CVA 的發生發展過程。鉤薄過敏顆粒低、高劑量組大鼠肺組織中TIMP-1、MMP-9 mRNA 和蛋白表達水平較模型組降低，其中對MMP-9 mRNA 和蛋白的抑制作用更為明顯。提示鉤薄過敏顆粒可有效改善CVA 大鼠咳喘癥狀、減輕氣道炎癥，其機制可能與下調TIMP-1、MMP-9 表達、抑制氣道重塑有關。