鉤薄過敏顆粒對CVA 大鼠肺組織基質(zhì)金屬蛋白酶9 及其抑制劑1 表達(dá)的影響*

劉振志，翟慧媛，袁亮亮，于 雷，盧 寧

1 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 藥學(xué)部，南京 210014；2 江蘇第二師范學(xué)院，南京 210013；3 南京市中心醫(yī)院，南京 210018

咳嗽變異性哮喘（cough variant asthma，CVA）于1972 年由Glauser 首次報(bào)道[1]，又名隱匿性哮喘、過敏性咳嗽。臨床主要癥狀為慢性咳嗽，無明顯喘息、氣促等癥狀；但有氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥，與哮喘類似。近年來，CVA 的發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢，嚴(yán)重威脅公眾健康，在我國CVA 占兒童慢性咳嗽比例高達(dá)41.95%[2]，約30%的患兒最終進(jìn)展為支氣管哮喘。在2002 年的《全球哮喘處理和預(yù)防策略》（GINA）上，提出它是支氣管哮喘的一種特殊形式，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，CVA 的發(fā)病機(jī)制與支氣管哮喘大致相同，主要為慢性非特異性氣道炎癥和氣道重塑[3]。

研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）可降解肺組織細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，且能調(diào)節(jié)蛋白酶和細(xì)胞因子的活性，在支氣管哮喘氣道重塑的病理過程中發(fā)揮著重要作用。基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）是MMP-9 的生理性抑制劑，其反應(yīng)性的升高可導(dǎo)致膠原沉積，進(jìn)一步引起氣道重塑[3]。本研究通過檢測大鼠肺組織MMP-9 和TIMP-1 mRNA 表達(dá)，進(jìn)而探究鉤薄過敏顆粒對咳嗽變異性哮喘大鼠氣道重塑的影響，更深入的闡述該品治療咳嗽變異性哮喘可能的作用機(jī)制。

1 材 料

1.1 藥品和試劑

鉤薄過敏顆粒由鉤藤、薄荷、桔梗、魚腥草、炙甘草、黃芪等配方顆粒組成（批號19041291，顆粒劑均采自江陰天江藥業(yè)有限公司），生理鹽水配制成1.342、2.863 g·mL-1的混懸液備用；醋酸地塞米松片（浙江仙琚制藥有限公司，5 mg/片，批號180687），生理鹽水配制成0.05 mg·mL-1的溶液備用。

卵蛋白（OVA）、氫氧化鋁（中國阿拉丁公司）；TIMP-1 抗體、MMP-9 抗體（Proteintech 公司）；βactin（Abcam 公司）；TRIzol（1596-026）（Invitrogen 公司）；SYBR Green PCR 試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒（均為Thermo 公司）；水為重蒸水。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

Multiskan MK3 酶標(biāo)儀（Thermo 公司）；Realtime 檢測儀（Bio-Rad 公司）；DYY-6C 型電泳儀（北京六一儀器廠）；420AI 超聲霧化器（江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司）；Sartorius B71250 電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad 公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

SPF 級健康SD 大鼠，雄性，30 只，6 周齡，體重180～240 g（上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供），生產(chǎn)許可證號為SCXK（滬）2018-0006，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號為SYXK（蘇）2017-0015。

1.4 引物

RT-PCR 引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。TIMP-1 擴(kuò)增片段大小為482bp，上游引物：5’-TGCAACTCGGACCTGGTTAT-3’，下游引物：5’-GGTTCTGGGACTTGTGGACA-3’；TIMP-1 擴(kuò)增片段大小為496bp，上游引物：5’-TGCGCTGGGCTTAGATCATT-3’；下游引物：5’-TGCAGTGGGACACATAGTGG-3’；β-actin 擴(kuò)增片段大小為287bp，上游引物：5’-ATCGTAAAGACC TCTATGC-3’；下游引物：5’-AACGCAGCTCA GTAACAGTC-3’。

2 方 法

2.1 動物模型建立、分組及給藥

將30 只雄性SD 大鼠按照體重隨機(jī)等分為5組，分別為：正常組、模型組、地塞米松（0.5 mg·kg-1）組、鉤薄過敏顆粒低、高劑量組（13.42、28.63 g·kg-1），每組6 只。除正常組外，其他組均按照以下方法造模：新配制的10%OVA 和Al（OH）3混合液1 mL 皮下注射致敏。注射方法為：每只大鼠取兩后足跖、腹股溝部、腰部、背部和頸部共10 點(diǎn)，每點(diǎn)皮下注射0.05 mL，同時(shí)腹腔注射0.5 mL，共計(jì)1 mL；1 周后重復(fù)1 次加強(qiáng)致敏。造模第15 天起，隔日上午霧化吸入：將大鼠置于密閉的有機(jī)玻璃罩中，用超聲霧化儀在400 mmHg 恒壓下噴入1% OVA 溶液20 min，激發(fā)哮喘。以大鼠腹肌明顯收縮為陽性，直到出現(xiàn)呼吸加深、加快、口鼻分泌物增多、劇烈嗆咳等呼吸道痙攣癥狀，提示造模成功。

空白組以生理鹽水替代OVA。各組于第15 天開始給藥，連續(xù)13 天，通過灌胃給藥（1 mL/100 g）。正常組和模型組給予同體積重蒸水。

2.2 動物處置及標(biāo)本制備

大鼠于第28 天末次給藥后，禁食不禁水12 h，腹腔注射10%水合氯醛（0.33 mL/100 g）進(jìn)行麻醉，處死動物。留取肺組織：打開胸腔，結(jié)扎左側(cè)肺門，切取大鼠左肺上葉組織，置于凍存管內(nèi)，隨后迅速移入-80 ℃液氮中凍存，以進(jìn)行RT-PCR 檢測mRNA 表達(dá)；切取左肺下葉組織放入凍存管，隨后迅速置于液氮中保存，以進(jìn)行Western-blot 檢測相關(guān)蛋白表達(dá)。

2.3 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測肺組織中TIMP-1 mRNA、MMP-9 mRNA 水平

①用TRIzol 法提取組織總RNA：稱取50～100 mg 組織，置于研缽中，加入少許液氮迅速研磨，研磨至粉末狀；轉(zhuǎn)移至無酶的1.5 mL 離心管中，加入1 mL TRIzol 劇烈振蕩，室溫裂解10 min；12 000 r·min-1離心5 min，棄沉淀，上清液加入總體積1/5 氯仿，渦旋振蕩15 s，室溫靜置10 min，12 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液于新的無酶1.5 mL 離心管中；加入等體積異丙醇，上下顛倒8～10 次，靜置10 min，12 000 r·min-1離心10 min，棄上清液；每管加入1 mL 焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水配制的75%乙醇，溫和振蕩懸浮沉淀，7500 r·min-1離心10 min，棄上清液，晾至半透明；加入50～100 μL DEPC 水溶解沉淀，待充分溶解后以熒光分光光度計(jì)檢測RNA 濃度。②RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA：在200 μL離心管中分別加入dNTP Mixture（各10 mmol·L-1），Oligodt 引物（2.5 μmol·L-1），總RNA（1 μg），RNAse Free ddH2O 補(bǔ)至總體積20 μL。在PCR 儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，37 ℃15 min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），85 ℃5 s（反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)）。③SYBRGreen 法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR：按照下述比例在冰上配制SYBRGreen（5X）10 μL，引物F（10 μmol·L-1）1 μL，引物R（10 μmol·L-1）1μL，上述cDNA 1μL，dd H2O 補(bǔ)至總體積20μL，上機(jī)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)。擴(kuò)增條件為：95℃3min 預(yù)變性后，95℃15s 變性，60℃60s 退火、72℃60 s 延伸，共循環(huán)40 次。④數(shù)據(jù)計(jì)算：ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，用2-ΔCt表示某樣本某基因表達(dá)水平，2-ΔΔCT計(jì)算基因表達(dá)的相對比值。

2.4 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測CVA 大鼠肺組織中TIMP-1、MMP-9 蛋白的表達(dá)

①樣品準(zhǔn)備：稱取50～100 mg 大鼠肺組織，少許液氮迅速研磨至粉末狀；轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP 管中，加入600 μL 含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液，40 V 冰上超聲30s，冰上裂解20min，4℃下12000r·min-1離心20 min，小心吸取上清液；Bradford 法測定蛋白濃度，酶標(biāo)儀上檢測蛋白濃度；加入5×SDS，95 ℃金屬浴10 min 變性蛋白，1×SDS 調(diào)至相同蛋白濃度備用。②Western blot：SDS-PAGE 膠配制，分離膠濃度10%；每孔上樣量20 μg，體積15～20 μL，80 V 電泳至濃縮膠結(jié)束，樣品進(jìn)入分離膠時(shí)間約30 min，分離膠120 V，60～90 min；將樣品從SDS-PAGE 膠轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，冰上100 V，60 min；配制5%脫脂奶粉放入轉(zhuǎn)膜后的PVDF 膜，室溫下于脫色搖床上60 min；一抗孵育：加入一抗4 ℃過夜；1×TBST，脫色搖床上10 min/次，重復(fù)3 次；二抗孵育：加入二抗室溫孵育60 min；洗膜：1×TBST，脫色搖床上10 min/次，重復(fù)3 次；顯色：配制化學(xué)發(fā)光顯色液，A∶B=1∶1，置于自動電泳凝膠成像分析儀曝光，Image J 軟件灰度掃描分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理。各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠肺組織TIMP-1、MMP-9mRNA 表達(dá)的比較

與正常組相比，模型組大鼠肺組織中MMP-9和TIMP-1 的mRNA 水平明顯升高（P＜0.01），與模型組相比，鉤薄過敏顆粒高劑量組MMP-9 和TIMP-1 的mRNA 水平顯著降低（P＜0.01），說明鉤薄過敏顆粒能夠抑制OVA 模型組肺組織MMP-9和TIMP-1 的表達(dá)。見表1。

表1 鉤薄過敏顆粒對TIMP-1 和MMP-9mRNA 表達(dá)水平的影響（±s，n=6）

表1 鉤薄過敏顆粒對TIMP-1 和MMP-9mRNA 表達(dá)水平的影響（±s，n=6）

3.2 各組大鼠肺組織TIMP-1、MMP-9 蛋白表達(dá)的比較

Western-blot 法檢測各組大鼠肺組織中TIMP-1 和MMP-9 蛋白表達(dá)水平，顯影結(jié)果見圖1。

圖1 各組肺組織TIMP-1、MMP-9 蛋白表達(dá)結(jié)果

用Image J 軟件對圖片進(jìn)行灰度掃描，記錄蛋白表達(dá)水平（以測定蛋白/β-actin 灰度值計(jì)），并進(jìn)行組間比較，結(jié)果見表2。

表2 鉤薄過敏顆粒對TIMP-1 和MMP-9 蛋白表達(dá)水平的影響（±s，n=6）

表2 鉤薄過敏顆粒對TIMP-1 和MMP-9 蛋白表達(dá)水平的影響（±s，n=6）

與正常組相比，模型組大鼠肺組織中TIMP-1和MMP-9 表達(dá)明顯增多（P＜0.01），而與模型組相比，鉤薄過敏顆粒低劑量組TIMP-1 蛋白表達(dá)無差異（P＞0.05），MMP-9 蛋白表達(dá)明顯減少（P＜0.01），地塞米松組和鉤薄過敏顆粒高劑量組TIMP-1 和MMP-9 表達(dá)降低（P＜0.01），有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義，說明鉤薄過敏顆粒能夠抑制CVA 大鼠肺組織中TIMP-1 和MMP-9 蛋白的表達(dá)。

4 討論

課題組前期研究已證實(shí)，鉤薄過敏顆粒治療CVA 臨床療效確切，并觀察到該品可以減少動物模型肺組織的炎性浸潤以及通過調(diào)控炎癥因子水平而減輕氣道炎癥[4，5]。鉤薄過敏顆粒以鉤薄過敏煎湯（以下簡稱“過敏煎”）（五味子、烏梅、銀柴胡、防風(fēng)）為基礎(chǔ)，具體有鉤藤、薄荷、銀柴胡、防風(fēng)、黃芪、桔梗、魚腥草、虎杖、生甘草、紫菀、烏梅、馬鞭草、款冬花等13 味中藥組成，鉤藤、薄荷為常用對藥，鉤藤息風(fēng)、解痙，薄荷解郁利咽，兩者配合可清熱解痙、利咽止咳；銀柴胡、黃芪、防風(fēng)、烏梅、甘草在臨床中有較強(qiáng)的抗變態(tài)反應(yīng)作用，具有祛風(fēng)止癢、解痙止咳之功，其中用黃芪代替過敏煎中五味子，取其補(bǔ)益肺氣、增強(qiáng)機(jī)體免疫力；魚腥草、虎杖、馬鞭草是臨床常用止咳對藥，有清熱、利咽、止咳、活血之功；桔梗、紫苑止咳化痰。全方“祛風(fēng)論治”，疏肝泄熱、熄風(fēng)止痙[6]。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)，在CVA 的發(fā)病過程中，慢性的氣道炎癥會引起氣道壁局部組織的損傷，而氣道重塑的最初原因是機(jī)體因?yàn)闅獾姥装Y所產(chǎn)生的反應(yīng)性修復(fù)，修復(fù)與損失的失調(diào)最終會起到重塑的發(fā)生。細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）在氣道壁的過多沉積是引起重塑的主要原因之一，也是CVA 的重要病理機(jī)制之一。基質(zhì)金屬蛋白酶-9 是調(diào)節(jié)ECM 代謝的主要限速酶。在CVA 發(fā)作期，MMP-9 升高，基底膜的完整性遭到破壞，大量炎性細(xì)胞浸潤氣道壁，導(dǎo)致氣道炎癥反應(yīng)及氣道高反應(yīng)性。MMP-9 還可黏附IL-8，并加強(qiáng)IL-8 作為中性粒細(xì)胞趨化因子的活性，活性加強(qiáng)后IL-8 的趨化作用至少高于正常的10 倍，因此肺組織中的MMP-9 水平與其炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度及ECM 沉積的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。此外，MMP-9 的持續(xù)性升高促進(jìn)其抑制因子基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1 反應(yīng)性升高，抑制膠原分解，導(dǎo)致膠原沉積。細(xì)胞外基質(zhì)成分在氣道壁的過多沉積可引起氣道壁的纖維化和氣流受阻，導(dǎo)致氣道重塑的發(fā)生[6，7]。

本研究顯示，CVA 大鼠模型組肺組織的TIMP-1、MMP-9 mRNA 和蛋白的表達(dá)顯著增加，提示TIMP-1、MMP-9 參與了CVA 的發(fā)生發(fā)展過程。鉤薄過敏顆粒低、高劑量組大鼠肺組織中TIMP-1、MMP-9 mRNA 和蛋白表達(dá)水平較模型組降低，其中對MMP-9 mRNA 和蛋白的抑制作用更為明顯。提示鉤薄過敏顆粒可有效改善CVA 大鼠咳喘癥狀、減輕氣道炎癥，其機(jī)制可能與下調(diào)TIMP-1、MMP-9 表達(dá)、抑制氣道重塑有關(guān)。