復方銀花解毒顆粒的指紋圖譜、多成分含量測定及多元統計分析

劉光大，吳建雄，王書源，黃 雁，楊琳妹，何樞衡

合肥億帆生物制藥有限公司，合肥 230000

復方銀花解毒顆粒是由10 味中藥組成的復方制劑。該方來源于臨床經驗方“銀花解毒湯”，方中山銀花、連翹為君藥。銀花味甘性寒，氣味芳香，連翹苦而微寒，輕清上浮，兩藥皆能解表透邪、清熱解毒。臣藥為荊芥、豆豉、薄荷，有疏散解表之功，共助君藥開皮毛而散熱。佐藥青蒿芳香透邪；大青葉清熱涼血；野菊花、鴨跖草清熱解毒；前胡宣散風熱，肅肺化痰。諸藥合用，具有疏表透邪、輕宣肺氣的作用，適用于普通感冒、流行性感冒的風熱癥候。

復方銀花解毒顆粒現行藥品標準收載于《新藥轉正標準》第75 冊，除薄層鑒別外，主要通過HPLC法對制劑中綠原酸含量進行定量分析，為便于全面控制藥品質量，宜建立更加有效的質量評價方法。

中藥指紋圖譜結合多個有效組分含量測定是控制中藥質量的有效方法[1]。聚類分析（CA）、主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘法-判別分析（OPLSDA）等化學計量學分析方法，可以充分整合指紋圖譜提供的多維信息，有利于揭示中藥復方制劑復雜成分間隱藏的規律[2]。本研究采用HPLC 法建立了復方銀花解毒顆粒的指紋圖譜，標定了來源于山銀花、連翹、青蒿、大青葉、野菊花等5 味藥材中的15個共有指紋峰；采用相似度評價結合上述化學計量學識別方法對指紋圖譜數據進行分析；同時對鑒別出的8 個化學成分進行含量測定，從定性與定量兩個方面對復方銀花解毒顆粒的質量進行評價。

1 材 料

1.1 儀器

Ultimate 3000 型高效液相色譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）；ME204E/MS105DU 型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-500DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品及試劑

對照品：綠原酸（批號110753-201817，純度96.8%）、連翹酯苷A（批號111810-201707，純度97.2%）、連翹苷（批號110821-201816，純度95.1%）、蒙花苷（批號111528-201911，純度98.5%）均購于中國食品藥品檢定研究院；新綠原酸（批號4974，純度98.0%）、隱綠原酸（批號3208，純度98.3%）、異綠原酸B（批號3089，純度99.7%）、異綠原酸A（批號7692，純度98.7%）、4，5-二-O-咖啡酰奎寧酸（批號3001，純度99.2%）均購于上海詩丹德標準技術有限公司。

供試品：復方銀花解毒顆粒（批號：190301、1903008、1903009、190312、190313、190315、190401、190402、190407、190408、180903、180906、180910、180911、180917，分別編號為S1-S15）由天長億帆制藥有限公司生產；山銀花、連翹、荊芥、淡豆豉、薄荷、青蒿、大青葉、野菊花、前胡、鴨跖草均購自芍花堂國藥股份有限公司。

乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil 100-5-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～10 min，5%～10%A；10～25 min，10%～13%A；25～50 min，13%～20% A；50～60 min，20%～32% A；60～65 min，32%～42%A）；指紋圖譜檢測波長230 nm，含量測定檢測波長330 nm；柱溫：30 ℃；體積流量：1.0 mL·min-1；進樣量：10 μL。理論板數按綠原酸峰計算應不低于5000。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 分別精密稱取對照品新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸A、4，5-二-O-咖啡酰奎寧酸、連翹苷、蒙花苷適量，置于100 mL 量瓶中，50%甲醇定容至刻度，即得（質量濃度分別為20.6、50.7、21.6、48.3、20.2、41.0、32.2、21.0、20.1 μg·mL-1）。

2.2.2 供試品溶液 取本品適量，研細，稱取約0.3 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理30 min（400 W，40 kHz），放至室溫，稱定重量，用50%甲醇補足失重，過濾，取續濾液，即得。

2.2.3 單味藥材顆粒樣品溶液 按本品現行的藥品標準中的制法，將處方中各味藥材分別制備成單味藥材顆粒，并按“2.2.2”項下方法制備單味藥材顆粒樣品溶液。

2.2.4 陰性顆粒樣品溶液 按本品現行的藥品標準中的制法，分別制備缺山銀花、連翹、野菊花、青蒿、大青葉5 味藥材的陰性顆粒，并按“2.2.2”項下方法制備陰性顆粒樣品溶液。

2.3 HPLC 指紋圖譜研究

2.3.1 進樣精密度試驗 取供試品（S15），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件檢測，連續進樣6 次。測得15 個共有峰保留時間的RSD 值均＜0.5%，峰面積的RSD 值均＜2.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 取供試品（S15）適量，按“2.2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件檢測。計算15 個共有峰保留時間和峰面積的RSD；計算各共有峰的峰面積RSD 時，以峰面積和取樣量的比值代替峰面積進行計算。結果表明，各共有峰保留時間的RSD 值均＜0.5%，峰面積的RSD 值均＜3.0%，表明該方法重復性良好。

2.3.3 穩定性試驗 取供試品（S15），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別在制備后的0、3、6、12、18、24 h，按“2.1”項下色譜條件檢測。測得15 個共有峰保留時間的RSD 值均＜0.5%，峰面積的RSD值均＜2.0%，表明供試品溶液在24 h 內穩定。

2.3.4 對照指紋圖譜的建立及相似度評價 取供試品15 批（S1～S15），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。采用2012版“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”分析指紋圖譜，選擇S1 做為參照圖譜，采用多點校正后進行Mark 峰匹配，生成對照指紋圖譜，結果見圖1。

將15 批供試品色譜圖與對照指紋圖譜進行相似度評價，S1～S15 相似度分別為0.991、0.990、0.990、0.990、0.995、0.990、0.976、0.976、0.976、0.976、0.976、0.977、0.981、0.982、0.962。15 批樣品與對照指紋圖譜的相似度均較高，表明不同批次樣品的質量較為接近。

2.3.5 共有峰指認與歸屬 按“2.2.1”、“2.2.2”、“2.2.3”、“2.2.4”項下方法制備對照品溶液、供試品溶液、單味藥材顆粒樣品溶液及陰性顆粒樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析。通過保留時間和DAD 紫外吸收圖譜對照分析，確定了各共有峰對應的化學成分和藥材歸屬。混合對照品、供試品以及陰性顆粒樣品的HPLC 色譜圖見圖2；供試品以及各單味藥材顆粒樣品的HPLC 色譜圖見圖3。各共有峰對應的化學成分和藥材歸屬見表1。

表1 復方銀花解毒顆粒共有峰歸屬

圖2 復方銀花解毒顆粒指紋圖譜峰指認結果

圖3 復方銀花解毒顆粒共有峰歸屬

2.3.6 聚類分析（CA）采用SPSS 25.0 軟件，以15批復方銀花解毒顆粒樣品中15 個共有峰的相對峰面積為變量，采用組間聯接系統聚類法，以平方歐氏距離（squared euclidean distance）為測度，進行聚類分析，結果見圖4。

當平方歐式距離為15 時，15 批供試品可聚為2 類：第Ⅰ類包括供試品S1～S10；第Ⅱ類包括供試品S11～S15。分析結果表明，不同批次復方銀花解毒顆粒的指紋圖譜存在一定差異，這可能與制劑所用藥材的批間質量差異有關。

2.3.7 主成分分析（PCA）采用SIMCA 14.1 軟件，以15 批復方銀花解毒顆粒樣品中15 個共有峰的峰面積為變量，進行主成分分析。分析結果表明，前2 個主成分的累計貢獻率為93.6%，能夠概括樣品數據的絕大部分信息。因此，本研究以貢獻率最大的2 個主成分為坐標軸，構建主成分平面，在損失少量信息的前提下，通過降維的方式將樣品的多元變量投影在二維平面上，觀察樣品的整體分布情況及各變量對樣品分布的貢獻大小[3]，結果見圖5、圖6。由圖5 得分散點圖可知，15 批供試品數據均落在95%置信區間內，說明各批次樣品化學成分基本一致，質量較為穩定；同時15 批供試品又可以分為2 類：第Ⅰ類包括樣品S1～S10，第Ⅱ類包括樣品S11～S15，與聚類分析結果較為一致。由圖6 載荷圖可知，15 個共有峰對樣品分布情況的貢獻不同，其中9 號峰、7 號峰、1 號峰、8 號峰、15 號峰、3 號峰、12 號峰、10 號峰距離中心點較遠，表明對復方銀花解毒顆粒樣品分布的貢獻率相對較大。

圖5 15 批復方銀花解毒顆粒PCA 得分散點圖

2.3.8 正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）在上述主成分分析的基礎上，對分為2 類的15 批樣品進行正交偏最小二乘法-判別分析，以篩選出對15 批樣品貢獻率較大的色譜峰，所得變量重要性投影值圖（VIP 圖）見圖7。

VIP 圖按照各成分對產品分類的影響大小進行各共有峰排序，成分的VIP 越大，對產品分類的貢獻越大，當VIP 值＞1 時，表明該成分對產品質量的影響具有統計學意義，可以選做差異標志物[4]。結合圖6 主成分分析載荷圖和圖7VIP 圖，共篩選出5個差異標志物，根據VIP 值大小依次為：峰9（連翹酯苷A）、峰7、峰8、峰1、峰3（綠原酸）；結合共有峰歸屬結果可知，這5 個峰主要來自君藥山銀花和連翹兩味藥材。

圖6 15 批復方銀花解毒顆粒PCA 載荷圖

圖7 15 批復方銀花解毒顆粒囊OPLS-DA 分析VIP 圖

2.4 含量測定

在上述研究的基礎上，對包括連翹酯苷A、綠原酸2 個差異標志物在內的8 個化學成分的含量進行定量分析。

2.4.1 溶液配制 對照品溶液、供試品溶液及陰性顆粒樣品溶液依次按“2.2.1”、“2.2.2”、“2.2.4”項下方法制備。

2.4.2 專屬性考察 按“2.2.1”、“2.2.2”、“2.2.4”項下方法制備對照品溶液、供試品溶液及陰性顆粒樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣檢測，結果見圖8。由此可知陰性樣品無干擾，本方法專屬性良好。

圖8 復方銀花解毒顆粒含量測定色譜圖

2.4.3 線性關系考察 按“2.2.1”項下方法制備含新綠原酸71.5 μg·mL-1、綠原酸272.0 μg·mL-1、隱綠原酸60.5 μg·mL-1、連翹酯苷A 165.7 μg·mL-1、異綠原酸B 137.1 μg·mL-1、異綠原酸A 183.1 μg·mL-1、4，5-二-O-咖啡酰奎寧酸189.0 μg·mL-1、蒙花苷88.2 μg·mL-1的混合對照品儲備液。取該儲備液，用50%甲醇溶液倍比稀釋，依次精密稀釋為原濃度的1/2 倍、1/4 倍、1/8 倍、1/16 倍、1/32 倍、1/64 倍的濃度，得到系列質量濃度的混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件依次進樣檢測。以對照品濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），進行線性回歸。8 個化學成分的回歸方程見表2。

表2 8 個化學成分回歸方程與線性范圍

結果表明，進樣體積為10 μL 時，8 個化學成分的質量濃度在一定的范圍內與峰面積呈良好線性關系。

2.4.4 進樣精密度試驗 取供試品（S15）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件檢測，連續進樣6 次。測得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸A、4，5-二-O-咖啡酰奎寧酸、蒙花苷8 個成分的峰面積RSD 均＜0.5%，表明儀器精密度良好。

2.4.5 重復性試驗 取供試品（S15）適量，按“2.2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，取“2.2.1”項下制備得到的對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件檢測對照品和供試品溶液。測得8 個成分的含量RSD 均＜1.5%，表明該方法重復性良好。

2.4.6 穩定性試驗 取供試品（S15）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別在制備后的0、3、6、12、18、24 h，按“2.1”項下色譜條件檢測。測得8 個成分峰面積的RSD 值均＜0.5%，表明供試品溶液在24 h 內穩定。

2.4.7 準確度試驗 取供試品（S15）約0.15 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入“2.4.3”項下混合對照品儲備液2 mL，其余操作步驟按“2.2.2”項下方法進行，制備供試品溶液，平行6 份；取“2.2.1”項下制備得到的混合對照品溶液；按“2.1”項下色譜條件檢測對照品和供試品溶液。根據檢測結果及對照品加入量，計算各成分的平均加樣回收率和RSD 值，計算得到新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸A、4，5-二-O-咖啡酰奎寧酸、蒙花苷的平均加樣回收率分別為100.3%、102.7%、99.2%、97.6%、101.6%、101.0%、102.2%、100.5%，RSD 值分別為1.2%、1.1%、1.5%、1.1%、0.7%、1.2%、0.8%、1.3%，表明該方法的準確度良好。

2.4.8 樣品測定 分別取15 批供試品（S1～S15）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液；取“2.2.1”項下制備得到的對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件檢測對照品和供試品溶液。計算樣品中8 個化學成分的含量，結果見表3。

表3 15 批復方銀花解毒顆粒中8 種成分含量測定結果（n=3）

現行質量標準規定，每袋（15 g）顆粒含綠原酸不得低于30 mg，即每克顆粒含綠原酸不得低于2 mg；由實驗結果可知，15 批供試品均符合現行標準規定，但是不同批次顆粒中各成分含量存在一定差異，這可能是該制劑所用藥材的質量存在差異所致。

3 討論

3.1 檢測方法的優化

本研究采用DAD 檢測器在190～400 nm 范圍內對供試品溶液進行全波長掃描，結果發現，在230 nm處色譜峰信息較為豐富，且基線較為平穩，故選擇230 nm 作為指紋圖譜檢測波長；新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸A、4，5-二-O-咖啡酰奎寧酸、蒙花苷8 種化學成分的最大吸收波長均在330 nm 附近；并且在330 nm 波長下，各色譜峰分離度良好，8 個成分的色譜峰峰純度匹配值均＞0.985，表明各色譜峰純度較高，故選擇330 nm 作為含量測定的檢測波長。

本研究考察了不同提取方式（回流、超聲）、不同提取溶劑（甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇、水）、不同提取時間（15、30、45 min）、不同流動相體系（乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液）、不同柱溫（25 ℃、30 ℃、35 ℃）等因素[5-8]的影響。結果表明，樣品采用50%甲醇25 mL 超聲提取30 min，可以兼顧提取效率、色譜峰峰型以及基線平穩度；當流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液、柱溫為30 ℃時，各色譜峰峰形和分離度較好。

3.2 指紋圖譜及模式識別分析

指紋圖譜結果顯示，15 批供試品與對照指紋圖譜的相似度均≥0.962，表明不同批次樣品間相似度較高，整體質量較為穩定。聚類分析和主成分分析均將15 批樣品分成2 類，這可能與不同批次制劑所用藥材產地、采收期各異等因素有關。OPLS-DA分析結果顯示，模型解釋率參數R2Y=0.999，預測能力參數Q2=0.995，均高于0.5，且兩者之差較小，說明模型擬合程度較好，具有較強的預測性和穩定性。設置分類Y 矩陣變量、隨機排列200 次做置換檢驗，R2擬合直線在Y 坐標軸的截距為0.184，低于模型解釋率R2Y（0.999），且＜0.3，說明所建模型可靠；得Q2擬合直線截距為0.757，低于模型預測度Q2，且＜0.05，說明所建模型可靠，不存在過度擬合現象[9]。PCA 和OPLS-DA 分析結果顯示，主要來源于君藥山銀花、連翹兩味藥材的峰9（連翹酯苷A）、峰7、峰8、峰1、峰3（綠原酸）對不同批次制劑的分類影響較大。為了提高產品的均一性和穩定性，后續應進一步加強對山銀花、連翹這兩味藥材的質量控制來減少批間質量差異；同時在生產過程中對這些差異標志物建立質量控制體系。

3.3 定量指標的選擇

本研究通過對照品對照指認出新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸A、4，5-二-O-咖啡酰奎寧酸、蒙花苷8 個成分。山銀花、連翹均具有清熱解毒、疏散風熱的功效[10]，其中綠原酸類多酚成分是山銀花中抗菌、抗病毒的主要有效成分[11]；連翹酯苷A 作為連翹的主要指標成分之一，具有顯著的抗炎、抗菌、抗病毒作用[12，13]。結合PCA和OPLS-DA 分析結果，選擇與制劑功效相關，且包含了連翹酯苷A 和綠原酸2 個差異標志物的8 個化學成分進行定量分析。

4 小 結

本研究采用HPLC 法建立了復方銀花解毒顆粒的指紋圖譜并同時測定多成分含量的分析方法，能夠全面反映出制劑的化學成分和定量信息，同時結合多元統計分析能系統地對復方銀花解毒顆粒進行全面的質量評價。該方法簡便、準確，可用于該制劑的整體質量控制，為全面評價該制劑質量提供參考依據。