枸櫞酸西地那非凝膠劑基質考察及體外溶出度測定*

姜孫旻，吳雪青，袁文博，余仁強，陸子紅，姚 熒**

1 南京醫科大學附屬無錫婦幼保健院 藥學部，無錫 214002;2 江南大學 藥學院，無錫 214000;3 南京醫科大學附屬無錫婦幼保健院新生兒科，無錫 214002；

近年來由于極低或超低體重出生兒存活率增加，支氣管肺發育不良并發的新生兒持續肺動脈高壓（persistent pulmonaryhypertension of the newbom，PPHN）成為兒科常見的危急重癥[1]。使用西地那非可以增加血管平滑肌cGMP，使NO 通路的血管擴張效果持續，對于PPHN 具有較好的療效[2]。目前枸櫞酸西地那非的市售制劑僅有口服片劑和口服混懸液，在臨床上通過稱量、飲用水分散后給新生兒服用。該方法存在操作繁瑣、給藥劑量不準確、易使療效降低等不足；此外，新生兒吞咽困難，臨床使用還存在易發生嗆咽等缺點[3]。因此，很有必要研發一種易于小兒服用的西地那非新劑型藥物。故采用明膠-蔗糖作為基質制備西地那非凝膠劑，既能夠包裹藥物、掩蓋苦味、準確給藥，又有利于小兒的吞咽，提高患者的順應性，改善藥物的療效。

1 材 料

1.1 主要儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；A560 型雙光束紫外可見分光光度計（翱藝儀器上海有限公司）；BSA124S 電子天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）；FE20 pH 計（梅特勒-托利儀器上海有限公司）；KQ-200KDE 型高功率數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Centrifuge 5424R 高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；Hybrid Discovery HR-3 流變儀（美國TA 儀器有限公司）；RC806D 溶出試驗儀（天大天發科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

枸櫞酸西地那非（Hetero Drug Ltd，批號：SD 18 090085；純度99.3%）；明膠為化學純；卡拉膠為藥用級；食用蔗糖；常用有機溶劑為分析純；所用試劑均為色譜純；水為純凈水。

2 方法與結果

2.1 枸櫞酸西地那非分析方法學的建立

2.1.1 溶液的配制 ①流動相：三乙胺（取7 mL 三乙胺，用水稀釋至1000 mL，磷酸調節pH 值至3.0）-甲醇-乙腈（58∶25∶17，V∶V∶V）為流動相。②枸櫞酸西地那非對照品溶液Ⅰ：精密稱取枸櫞酸西地那非原料藥35 mg 置50 mL 量瓶中，用以上述流動相作為溶劑稀釋至刻度，再從中精密量取2 mL 于50 mL量瓶中，稀釋至刻度，用0.45 μm 尼龍濾膜過濾，得到質量濃度為28 μg·mL-1對照品溶液[4]。③枸櫞酸西地那非對照品溶液Ⅱ：精密稱取枸櫞酸西地那非原料藥50 mg 置50 mL 量瓶中，以流動相作為溶劑，稀釋至刻度，從中精密量取5 mL 于50 mL 量瓶中，再稀釋至刻度，用0.45 μm 尼龍濾膜過濾，得到質量濃度為100 μg·mL-1對照品溶液。

2.1.2 最大紫外吸收波長的確定 取枸櫞酸西地那非對照品溶液Ⅰ，使用紫外分光光度計將其在波長200～400 nm 范圍內進行紫外全波長掃描，測定其紫外吸收，確定最大吸收波長，以此確定HPLC 法的最佳檢測波長，結果見圖1。因在190～210 nm 處很多溶劑都有末端吸收，故選擇290 nm 為枸櫞酸西地那非的檢測波長。

圖1 枸櫞酸西地那非紫外可見光光譜圖

2.1.3 色譜條件 參考《美國藥典》（USP 40）[5]，采用高效液相色譜法進行測定。色譜柱：ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：三乙胺-甲醇-乙腈（58∶25∶17，V∶V∶V）；柱溫：30 ℃；檢測波長：290 nm；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：20 μL。

2.1.4 專屬性 按“2.1.1”項下配制流動相作為空白溶劑與枸櫞酸西地那非對照品溶液Ⅱ，按“2.1.3”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，結果見圖2。由圖2 顯示，空白溶劑不干擾枸櫞酸西地那非的檢測，枸櫞酸西地那非色譜峰與相鄰色譜峰分離良好，表明該色譜條件專屬性良好。

圖2 枸櫞酸西地那非專屬性圖

2.1.5 標準曲線建立 取對照品溶液Ⅱ，用流動相稀釋配制成系列梯度濃度的線性工作溶液（100、80、60、40、30、20、10、5 μg·mL-1），以10 000 r·min-1離心10 min，取上清液，按“2.1.3”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖與峰面積。以峰面積（Y）對系列濃度（X，μg·mL-1）繪制線性回歸的標準曲線，得回歸方程為Y=25.58X-2.9823（r2=0.999 7）。結果表明，枸櫞酸西地那非在濃度5.22～104.40 μg·mL-1的范圍內線性關系良好。

2.1.6 儀器精密度 取枸櫞酸西地那非對照品溶液Ⅱ，按“2.1.3”項下色譜條件連續進樣6 次，記錄相應峰面積。枸櫞酸西地那非峰面積的RSD 為0.40%（n=6）。RSD＜2%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 方法精密度 配制5、30、80 μg·mL-1濃度的枸櫞酸西地那非溶液，低、中、高3 個濃度各配制3份，按“2.1.3”項下色譜條件進樣分析，記錄相應峰面積。結果顯示，低、中、高濃度的RSD 分別為1.37%、0.30%、1.93%（均n=3）。RSD 均＜2%，說明方法精密度良好。

2.1.8 穩定性試驗 取枸櫞酸西地那非對照品溶液Ⅱ，密封于室溫下放置0、24、48 h，按“2.1.3”項下色譜條件進樣分析，記錄相應峰面積。計算枸櫞酸西地那非穩定性試驗RSD 為0.166%（n=3）。RSD＜2%，表明枸櫞酸西地那非對照品溶液在室溫下48 h內基本穩定。

2.2 凝膠基質的處方工藝考察

2.2.1 增溶劑的選擇 選擇3 種常用的增溶劑泊洛沙姆F68、泊洛沙姆F127 和聚乙二醇4000（PEG4000）進行增溶試驗，分別測定增溶劑用量為1%、2%、5%時的枸櫞酸西地那非的溶解度，結果見表1。最終選擇5%的泊洛沙姆F127 溶液作為處方的增溶劑。

表1 枸櫞酸西地那非溶解度

2.2.2 凝膠基質的選擇 通過查閱相關文獻[6，7]，以及對不同凝膠劑的性價比進行調研后，選擇明膠（10%、12%、14%、16%、18%（w/V））和卡拉膠（0.5%、1%、2%（w/V））進行感觀評價，以選擇較優的凝膠基質與用量。制定感官評分標準：請10 名（5 男5 女）評價員[8]根據透明度、細膩度、強度、氣味進行評分，各項分別占20、30、20、30 分，取其平均值作為最終評分結果，滿分為100 分。結果表明，明膠基質色澤明亮，質地均勻光滑、粘彈性適度、無特殊氣味，其得分均高于卡拉膠，故更適合作為吞咽困難患者服用的凝膠基質。

2.2.3 凝膠基質持水性試驗 取不同質量濃度的明膠溶液1 mL 于1.5 mL EP 管中，待其膠凝后稱重，放置冷凍高速離心機中，以10 000 r·min-1離心20 min，吸去上層析出的水分，再次稱重，按公式（1）計算其持水力（water holding capacity，WHC）[9]。

式中：M1為離心前裝有凝膠的離心管質量（g）；M2為吸去水分后離心管質量（g）。

每個樣品平行制備3 份，見圖3。結果表明，明膠濃度為10%時具有較高的持水性，能夠避免制劑在口腔黏膜上粘附。

2.2.4 基質粘彈性試驗 將不同質量濃度的明膠基質制備成直徑為50 mm、厚度為5 mm 的圓形薄片，選用型號104717，錐角為4∶0∶43（deg∶min∶sec），錐板直徑為40 mm，截斷參數為109 μm 的錐板夾具，用HR-3 流變儀在流動模式下進行動態頻率測試，掃描頻率為0.1～100 rad·s-1，儀器平衡時間為5 s，樣品測試平均時間為30 s，所有測試均在常溫（25 ℃）條件下進行。按照公式（2）[10]計算損耗因子。

式中：tan δ 為損耗因子；G″為損耗模量（Pa）；G′為儲能模量（Pa）。

每個樣品平行做3 次，結果見圖4。由圖4 顯示，在0.1～100 rad·s-1范圍內，所測樣品的G′均比G″大一個數量級，tan δ 小于1，并且隨著角頻率ω的增加，所測樣品的tan δ 都略有增加。這表示所測樣品的動態模式中，彈性（固體特征）均高于粘性（液體特征），并且通過剪切可降低樣品的彈性。在5種濃度的樣品中，10%明膠基質具有更低的tanδ，說明此濃度下的明膠基質粘性小，彈性大，能夠在擠壓時減輕患者的服用負荷。

2.2.5 矯味劑蔗糖的考察 以10%明膠作為基礎，加入不同比例的蔗糖，配制成蔗糖濃度為1%、2%、3%、4%、5%（w/V）的明膠-蔗糖基質。按、“2.2.2”、“2.2.3”、“2.2.4”項下方法進行感觀評價、持水性、粘彈性試驗。持水性、粘彈性結果分別見圖3、圖4。

結果顯示，當配比為10%明膠-3%蔗糖時，基質光滑透明、色澤悅目、口感適宜，且具有良好的持水性以及粘彈性。

2.2.6 優化處方組成及制備工藝 處方組成為枸櫞酸西地那非1%、2%、3%，泊洛沙姆F127 5%，明膠10%，蔗糖3%。其制備工藝：稱取泊洛沙姆F127 適量溶于，蒸餾水中配制成5%溶液，加入適量的枸櫞酸西地那非，室溫下攪拌溶解。再加入處方量明膠、蔗糖，在水浴70 ℃下攪拌溶解。待溶解完全后，水浴攪拌下降至37 ℃，放置于冰箱4 ℃冷卻至半固態。

2.3 含量測定

2.3.1 樣品制備 按“2.2.6”項下確定的處方及工藝，制備濃度為1、2、3 mg·mL-1的3 種規格的枸櫞酸西地那非凝膠劑。

2.3.2 含量測定 分別從濃度為1、2、3 mg·mL-1的3 種凝膠劑中精密稱取1 g 凝膠，切成大小均勻的細塊，置于50 mL 量瓶中，加入適量流動相溶解，超聲至凝膠完全溶解后，以流動相稀釋至刻度。按“2.1.3”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。按外標一點法計算半固體凝膠中的藥物含量，每個樣品平行制備3 份。結果顯示，在1～3 mg·mL-1范圍內，藥物回收與投藥量存在線性關系，Y=0.823X+0.053（r2=0.998 9），可設定為枸櫞酸西地那非凝膠劑的藥物含量。

2.4 凝膠劑溶出度試驗

2.4.1 樣品制備 分別從濃度1、2、3 mg·mL-1的3種枸櫞酸西地那非凝膠劑中精密稱取10 g 凝膠，將其切割成大小均勻的小塊備用。

2.4.2 溶出度試驗 按照《中國藥典》（2015 版）溶出度測定第二法（槳法）[11]，以0.1 mol·L-1鹽酸溶液900 mL 為溶出介質（37 ℃±0.5 ℃），轉速設定為50 r·min-1。將制備好的樣品投入溶出杯內，開始計時，然后按間隔5、10、15、30、45、60、120 min 定時取樣。每次取樣5 mL，用0.45 μm 聚醚砜濾膜過濾，取續濾液，按“2.1.3”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積，按公式（3）計算枸櫞酸西地那非凝膠劑的累積溶出度。每個樣品平行制備3 份；結果見圖6。

枸櫞酸西地那非凝膠劑在5 min 時藥物溶出度已經超過90%，在2 h 內藥物溶出度維持在95%左右，能夠充分釋放藥物，有利于患者吸收。

式中：A對為枸櫞酸西地那非對照品溶液的峰面積；A0為枸櫞酸西地那非凝膠劑0 時刻溶液的峰面積（此時峰面積為0）；An為枸櫞酸西地那非凝膠劑第n 個時間點溶液的峰面積（n≥1）；C對為枸櫞酸西地那非對照品溶液濃度（mg·mL-1）；V1為補充溶出介質體積/mL（本實驗中為5 mL）；V2為溶出介質體積/mL（本實驗中為900 mL）；m理論為枸櫞酸西地那非凝膠劑的理論含藥量/mg。

3 討論

果凍型凝膠劑是一種含藥物的吞咽輔助型凝膠劑，具有改善藥物吞咽、掩蓋藥物異味、飲用方便等優點[12]。有研究針對治療老年人的骨質疏松癥、制備了負載阿侖膦酸酯藥物的口服凝膠，適用于吞咽困難的老年患者，提高其用藥順應性[13]。此類制劑在穩定性、劑量準確性、使用方便性、患者依從性等方面都具有很大的優勢。

在凝膠劑制備過程中，最重要的成分是膠凝劑，本研究考察了明膠和卡拉膠，前者在持水性、均一性、粘彈性、透明度、口感等方面均良好。

枸櫞酸西地那非在《中國藥典》中并未收錄，本研究參考了《美國藥典》（USP 40），建立了體外溶出度測定法，并通過專屬性、精密度、線性范圍、穩定性等進行方法學驗證，為枸櫞酸西地拉非凝膠劑的含量及體外溶出測定提供了可靠、準確的分析方法。

臨床上口服西地那非治療PPNH 常用劑量為0.5～1 mg/次，每6 h 服用一次，可顯著降低患兒肺動脈壓力[1]。該凝膠劑處方中使用了增溶劑，對枸櫞酸西地那非進行增溶，使其溶解度顯著提高至3.5 mg·mL-1，所設計的載藥量為1～3 mg·mL-1的凝膠劑能被完全溶解，并且增加載藥量能夠減少用藥體積，提高新生兒的用藥順應性。通過考察，確定了載藥量1～3 mg·mL-1為制劑設定的規格。

經體外溶出度試驗，該凝膠劑在5 min 時藥物累計溶出已經超過90%，說明在胃中能夠快速且有效地釋放，利于患兒吸收。

研制枸櫞酸西地那非凝膠劑，有望達到吞咽時無異物感、改善藥物療效、提高患者依從性等目的，具有開發的潛力。