HSCT 患兒血漿中白消安的濃度測定及暴露量研究*

杜小換，黃晨蓉，胡紹燕，劉筱雪，董 吉，朱增燕，劉紀松，李 芳，王文靜，繆麗燕**

1 蘇州大學附屬兒童醫院 藥劑科，蘇州 215025；2 蘇州大學附屬第一醫院 藥學部，蘇州 215006；3 蘇州大學附屬兒童醫院 血液科，蘇州 215025；4 浙江佰辰醫療科技有限公司，杭州 310000

白消安（BU）是兒童造血干細胞移植（HSCT）預處理方案中的重要組成藥物。根據國際血液和骨髓移植研究中心（CIBMTR）的分類方法，BU 總劑量大于9 mg·kg-1的預處理方案為清髓方案（MAC），BU低于此劑量的方案為降低強度預處理方案（RIC）。MAC 方案下的多項研究表明，在兒童患者中BU 藥動學存在個體差異性[1，2]，且BU 治療窗范圍窄，BU體內暴露與HSCT 患者的移植后治療結局及毒副作用存在顯著相關性，最佳暴露范圍尚有待確立[3]。國外多個移植中心通過開展BU 治療藥物監測（TDM）探索兒童患者的BU 最佳暴露范圍，以期改善移植治療結局，減少BU 高暴露產生的毒性反應[4，5]。由于RIC 方案中BU 用藥療程更短（1～2 天），這對TDM的時效性要求非常高，因此目前RIC 方案下的相關研究少，尤其是在兒童患者中[6]。

根據文獻報道，BU 血藥濃度檢測方法主要有高效液相色譜法（HPLC）[7，8]和液相色譜串聯質譜法（LC-MS/MS）[9，10]等。其中LC-MS/MS 法具有檢測特異性、靈敏度、準確度高及檢測速度快等優點，日漸成為TDM 主流分析技術和檢測“金標準”。

本研究擬建立LC-MS/MS 法檢測患兒血漿中BU 藥物濃度，并對RIC 方案下患兒體內BU 暴露情況進行估算，為進一步開展兒童HSCT 患者BU 藥動學和藥效學研究提供技術支持和理論參考。

1 材 料

1.1 儀器與設備

高效液相色譜串聯質譜聯用儀（Waters 公司，型號Xevo TQD，配備電噴霧離子化源（ESI）以及MassLynx V4.1 數據處理軟件）；電子分析天平（Mettler Toledo 公司，型號XS105DU）等；超純水儀（Millipore 公司，型號Direct-Q5 UV）；臺式高速離心機（北京白洋醫療器械有限公司，型號G20）。

1.2 藥品和試劑

BU 對照品（純度＞98%，批號S1111AS，大連美侖生物技術有限公司）；BU-D8 對照品（純度為≥98%，批號D021161-1004，CFW Laboratories，Inc）；BU 注射液（規格10 mL：60 mg，Otsuka Pharmaceutical Co.，Ltd.）；甲醇、乙腈、甲酸為色譜純；試驗用水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEHC18（50mm×2.1 mm，1.7 μm）；以含10 mmol·L-1甲酸銨和0.1%甲酸的水溶液為水相（A），以含0.1%甲酸的乙腈溶液為有機相（B），采用梯度洗脫法（程序為：0～0.5 min，95%A；0.5～1.5 min，95%A→5%A；1.5～2.2 min，5%A；2.2～2.3 min，5%A→95%A；2.3～3 min，95%A）；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進樣量：2 μL。

2.2 質譜條件

采用ESI 和多反應監測（MRM）模式檢測；毛細管電壓：3.0kV；離子源溫度：150℃；脫溶劑溫度：400℃；脫溶劑氣流速：800L·h-1；錐孔氣流速：20L·h-1。BU 離子通道為m/z 264.10→150.90；錐孔電壓為25 V，碰撞能量10 V；BU-D8 離子通道為m/z 272.10 →159.10，錐孔電壓為25 V，碰撞能量11 V。

2.3 溶液配制和處理

2.3.1 對照品溶液 精密稱取BU 對照品11.90 mg，置于30 mL 棕色玻璃瓶中，用電子移液器精密加入乙腈11.67 mL 使溶解，制成濃度為1.0 mg·mL-1的BU 對照品儲備液；取該液適量，然后用甲醇-水（1∶1，V∶V）定量稀釋，制成其質量濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 和100.0 μg·mL-1的系列對照品溶液，以及其質量濃度為1.5、15.0、80.0 μg·mL-1的質控（QC）溶液。

2.3.2 內標溶液 精密稱取BU-D8 對照品10.00mg，置于10 mL 容量瓶中，用甲醇-水（1∶1，V∶V）溶解并稀釋至刻度，制成濃度為1.0 mg·mL-1的BU-D8 內標儲備液，取該液適量，用乙腈定量稀釋制成濃度為0.25 μg·mL-1內標乙腈溶液。

2.4 血漿樣品配制和處理

取空白血漿90 μL 加入1.5 mL 離心管中，分別加入“2.3.1”項下不同質量濃度的BU 對照品溶液以及QC 溶液各10 μL，得到標準曲線和QC 血漿樣品，然后分別加入0.25 μg·mL-1的BU-D8 乙腈溶液300 μL，渦旋混勻3 min，15000 r·min-1離心8 min，取上清液100 μL 至進樣瓶中，進樣量2 μL。

2.5 專屬性考察

分別取6 份不同來源的空白血漿、標準血漿樣品和患者用藥后的血漿樣本，除空白血漿中用乙腈等量代替BU 對照品溶液和BU-D8 內標溶液外，其余按照“2.4”項下的操作方法進行配制、處理，然后進樣測定，分別記錄色譜圖，見圖1、圖2、圖3。由圖可見，BU 和BU-D8 的保留時間均為1.34 min；血漿內BU 和BU-D8 內標物的峰形良好，分離較為完全，不受血漿中內源性物質干擾。

圖1 空白血漿色譜圖

圖2 BU 標準血漿樣品（0.2 μg·mL-1）與BU-D8內標物色譜圖

圖3 某患者BU 首劑給藥后2 h 血漿樣本與BU-D8內標物色譜圖

2.6 標準曲線繪制

按照“2.4”項下方法操作，制備不含對照品和內標的空白血漿樣品1 份、不含對照品含內標的空白血漿樣品1 份，以及濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg·mL-1的標準曲線血漿樣品7 份，處理后進樣測定。

以BU 濃度（μg·mL-1）為橫坐標（X），BU 與內標物BU-D8 峰面積的比值（ABU/ABU-D8）為縱坐標（Y），采用加權最小二乘法進行回歸運算，求得直線回歸方程為：Y=1.416X+0.0103（r=0.999），BU 濃度在0.1～10.0 μg·mL-1范圍內線性關系良好，定量下限（LLOQ）為0.1 μg·mL-1。

2.7 準確度和精密度

按照“2.4”項下的操作方法分別配制LLOQ，低、中、高4 個濃度的QC 血漿樣本各6 份，處理后進樣分析，連續測定3 批。批內和批間準確度（RE）分別為101.4%～103.7%和101.1%～103.5%，批內和批間精密度（RSD）分別為4.3%～5.1%和3.2%～6.9%，均符合《中國藥典》2020 年版的要求。見表1。

表1 BU 精密度、準確度實驗結果（n=6）

2.8 提取回收率和基質效應

按照“2.4”項下的操作方法分別配制和處理低、中、高血漿樣品各6 份，定為A1 組；取6 個不同來源的空白血漿各100 μL，先加入乙腈進行蛋白沉淀后取上清液，再分別加入等量3 個不同濃度BU QC溶液和BU-D8 內標溶液，定為A2 組；以A1 組中BU 峰面積與A2 組中BU 峰面積的均值之比計算提取回收率。以等體積純化水代替空白血漿，分別加入3 個不同濃度BU QC 溶液各10 μL，定為A3組；以A2 組BU 和BU-D8 峰面積與A3 組中BU 和BU-D8 峰面積的均值之比分別計算基質因子，再計算經內標歸一化的基質因子。結果顯示，平均提取回收率為（111.2±11.8）%，經內標歸一化的基質效應均＜15%，說明該方法提取過程中藥物幾乎沒有損失，基質對BU 和BU-D8 內標物的測定影響較小。見表2。

表2 BU 提取回收率與基質效應實驗結果（n=6）

2.9 穩定性試驗

分別配制低、高兩個濃度的血漿樣本各3 份進行穩定性試驗。結果顯示，BU 血漿樣品在室溫放置4 h、經歷反復凍融3 次和血漿樣品處理后進樣器內放置24 h 條件下均可保持穩定，見表3。

表3 BU 血漿樣品穩定性實驗結果（±s，n=3）

表3 BU 血漿樣品穩定性實驗結果（±s，n=3）

2.10 血漿中的BU 濃度測定與體內暴露量計算

收集蘇州大學附屬兒童醫院血液科移植病房中采用RIC 方案的病例，即BU 基于患兒體重，按0.8 mg·kg-1計算每劑給藥量，每劑持續靜脈輸注2 h，每天給藥4 次，連續用藥2 天。分別采集BU首劑給藥后即刻（記為2 h）、4 h、6 h 外周靜脈血約2 mL，記錄準確采血時間（精確到分鐘），血樣收集于EDTA 抗凝管內，于0.5 h 內轉移至實驗室，以4000 r·min-1離心5 min 分離血漿，按照“2.4”項下處理后進行血藥濃度測定。使用NextDose 貝葉斯回歸模型分別計算患兒體內BU 的暴露情況（以AUC 表示）。

本研究入組患兒21 例，中位年齡為5.4 歲（2.0～15.8 歲），體重18 kg（11～60 kg），BU AUC 中位值為1191.23（775～2511.57）μmol·min·L-1，其他臨床信息見表4。

表4 RIC 方案下患兒臨床信息及BU 暴露結果

3 討論

本研究使用BU-D8 同位素內標，建立了測定HSCT 患兒血漿中BU 濃度的LC-MS/MS 法，該方法采用乙腈進行蛋白沉淀，前處理操作簡單快速，蛋白沉淀完全。在流動相的選擇方面，首先以0.1%甲酸水溶液為水相，乙腈為有機相，但試驗后發現BU 及內標物BU-D8 的響應值均較低，故而參考文獻[9]嘗試將水相中加10 mmol·L-1甲酸銨，有機相中加入0.1%甲酸，響應明顯提高。該方法中血漿用量少（100 μL），適合兒童患者開展BU治療藥物檢測。

經模型估算，本研究中RIC 方案下21 例患兒首劑給藥后的BU 暴露量存在個體差異性，這與MAC 方案下的其他研究結論一致[11-13]。與美國FDA推薦方案下[14]的目標暴露范圍（900～1350 μmol·min·L-1）相比，本研究中有33.3%的患者未能達到目標值。因此，患者移植后療效以及毒副反應發生情況有待繼續隨訪，應通過進一步分析BU AUC 在患兒個體間出現差異的影響因素以及不同暴露情況下患兒的移植后療效及安全性，建立BU 最佳暴露范圍，從而達到實現BU 個體化給藥，改善患兒移植治療結局的目的。