谷胱甘肽硫轉移酶及乙醛脫氫酶基因多態性對環磷酰胺方案治療膜性腎病的效果與不良反應的影響研究*

錢 卿，胡 楠**，周 華，凌 靜，陳 榮，鄒素蘭，王莉英

常州市第一人民醫院 1 藥學部；2 腎內科,常州 213003

特發性膜性腎病（idiopathic membranous nephropathy，IMN）是一種腎臟特異性的自身免疫性腎小球疾病，是成人腎病綜合征最常見的病理類型之一[1]。一項研究分析了來自中國938 家醫院71 151例患者的腎活檢報告，其中膜性腎病的發病率為23.4%，僅次于IgA 腎病（28.1%）[2]。環磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）聯合糖皮質激素的治療方案是“改善全球腎臟病預后（kidney disease improving global outcomes,KDIGO）”指南推薦的首選方案之一，其總體緩解率可達72%，10 年內的不透析生存率為89%[3]。然而，CTX 在不同患者個體間的療效與不良反應仍存在顯著的差異性，藥物基因組學研究表明，可能與CTX 體內藥動學過程相關的代謝酶和轉運體的基因多態性有關。代謝酶主要涉及細胞色素P450（cytochrome P450，CYP）2B6、2C9、2C19、3A4、3A5，谷胱甘肽硫轉移酶（glutathione S transferases，GST）和乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）等，轉運體包括多藥耐藥相關蛋白4（multidrug resistance-associated protein 4，MRP4）和P-糖蛋白（P-gp）[4]。

本研究旨在探討GST 和ALDH 基因多態性對CTX 方案治療IMN 的效果與不良反應的影響，為精準治療及藥學監護提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2018 年1 月至2019 年12 月于本院腎內科行腎臟穿刺活檢、病理診斷為膜性腎病，且采用CTX 方案的患者共計65 例。本研究經本院醫學倫理委員會審批通過，所有患者均簽署知情同意書。

納入標準：腎臟病理明確診斷為膜性腎病的患者；治療方案為糖皮質激素聯合CTX 靜脈沖擊治療，且療程達到1 年及以上；開始CTX 方案治療前3 個月未使用過其他免疫抑制劑。

排除標準：未嚴格遵循方案規律行CTX 沖擊治療的患者；改用其他免疫抑制劑的患者；療程＜1 年無法評價療效或不良反應的患者；有嚴重的心血管系統、呼吸系統、血液系統、肝臟疾病或癌癥；無法控制的嚴重感染；妊娠、哺乳及有生育計劃的育齡期女性；依從性差、隨訪不配合者；年齡＜18 歲。

1.2 用藥方案

二聯免疫抑制治療采用中等劑量醋酸潑尼松片（0.5mg·kg-1·d-1）或等效劑量甲潑尼龍片口服，聯合CTX（商品名：安道生，規格：0.2 g/支，Baxter Oncology GmbH 公司）每月靜脈沖擊治療。CTX 方案為：①治療開始的前6 個月：每月靜脈沖擊治療一次，劑量為0.8g/次，即0.4 g CTX 溶于生理鹽水250 mL 中，連續靜滴2 天；②治療6 個月后：根據患者病情改善情況，減量至每2～3 個月靜脈沖擊治療一次，劑量為0.8 g/次，分2 天給予。

1.3 療效及不良反應評價

療效評價標準為：①完全緩解：24 h 尿蛋白定量＜0.3 g·d-1，血漿白蛋白正常（≥35 g·L-1），腎功能穩定；②部分緩解：24 h 尿蛋白定量0.3～3.5 g·d-1且低于尿蛋白基線值50%以上，血漿白蛋白≥30 g·L-1，腎功能穩定；③未緩解：24 h 尿蛋白定量≥3.5 g·d-1和（或）尿蛋白下降＜基線值50%。

不良反應評價標準參考美國國立癌癥研究所《通用不良事件術語標準》（CTCAE v4.0），重點記錄患者在治療過程中發生的嚴重胃腸道反應、肝腎功能損傷、骨髓抑制、感染性疾病等不良反應。評判標準如下：胃腸道反應包括惡心、嘔吐、腹痛或腹瀉等；肝功能損傷：谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶或總膽紅素升高≥正常值上限1.5 倍（排除其他引起肝功能損害因素）；腎功能損傷：血清肌酐升高至＞正常值上限或基礎值的1.5 倍以上；骨髓抑制：白細胞計數＜3.5×109/L 和（或）中性粒細胞計數＜1.5×109/L。

1.4 基因型分析

采用聚合酶鏈式反應（PCR）-直接測序法檢測膜 性腎病患者GSTP1 A313G（rs1695）、ALDH3A1（rs2228100）的基因型，儀器采用美國Applied Biosystems 公司3730XL 型DNA Analyzer。

DNA 提取：取患者外周靜脈血2 mL 置EDTA抗凝管中，按照全血基因組DNA 提取試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）說明書操作步驟提取DNA，并通過紫外分光光度法測定所提取基因組DNA 的濃度和純度。

PCR 引物設計：采用Primer 5.0 軟件設計擴增引物及測序引物，見表1。所有引物均由生工生物工程上海股份有限公司合成。

表1 聚合酶鏈式反應和延伸反應引物

擴增反應體系及條件：PCR 反應體系包括DNA 模板1 μL（約100 ng），上游引物及下游引物（10 pmol·μL-1）各1 μL，10×Buffer 5 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol·L-1）4 μL，rTaq DNA 聚合酶（5 U·μL-1）0.5 μL，加滅菌雙蒸水至25 μL。rs1695 的PCR 反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s，共35 個循環，最后72 ℃延伸5 min。rs2228100 的PCR 反應條件：95℃預變性3 min；95 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72℃延伸40 s，共35 個循環，最后72 ℃延伸5 min。

1.5 統計學處理

采用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析。用χ2檢驗等位基因分布是否符合Hardy-Weinberg 平衡。在療效影響因素的單因素分析中，分類變量采用非參數檢驗，連續變量如數值符合正態分布則采用單因素方差分析，不符合正態分布則采用非參數檢驗；在單因素分析中，有顯著影響的因素進一步納入多因素研究，多因素分析采用有序Logistic 回歸。考察基因多態性對不良反應的影響，采用χ2檢驗或Fisher’s 精確檢驗，當預測頻數＜5 時，采用Fisher’s精確檢驗，當預測頻數≥5 時，采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 一般資料

最終納入65 例患者，男39 例，女26 例。患者治療前的基礎資料，尿蛋白定量（24 h）、血清白蛋白（ALB）、尿素氮（BUN）、血清肌酐（SCr）等檢測指標見表2。

表2 膜性腎病患者的人口學統計資料及實驗室指標

2.2 基因型及等位基因頻率

GSTP1 rs1695 A 和G 等位基因的頻率分別為74.62%和25.38%，ALDH3A1 rs2228100 C 和G 等位基因的頻率分別為46.15%和53.85%。通過χ2檢驗，以上各基因型分布均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡（P＞0.05），研究資料具有群體代表性。

2.3 CTX 方案治療膜性腎病的療效影響因素分析

CTX 聯合糖皮質激素方案治療膜性腎病患者的總體緩解率達78.5%，其中完全緩解率為41.5%，部分緩解率為36.9%，而未緩解率為21.5%。在單因素分析中，逐個考察性別、年齡、體重、體重指數、治療前24 h、治療前ALB、治療前BUN、治療前SCr、GSTP1 和ALDH3A1 不同基因型對療效的影響。結果顯示，性別、體重、GSTP1 rs1695 基因型對療效存在顯著影響（P=0.003、P=0.032、P=0.047），見表3。

表3 12 個月疾病緩解率的單因素分析

將單因素分析中有顯著影響的因素進一步納入多因素分析，結果表明，女性患者出現部分緩解或未緩解的可能性顯著低于男性患者（P=0.017），女性患者出現部分緩解或未緩解的可能性僅為男性患者的25.6%，故性別是12 個月疾病緩解率的獨立影響因素。盡管GSTP1 rs1695 GG 型的疾病完全緩解率是AA 型的2.5 倍（75.00% vs 30.00%），但GSTP1 rs1695 基因型并非12 個月疾病緩解率的獨立影響因素（P＞0.05），見表4。

表4 12 個月疾病緩解率的多因素分析

本次多因素分析的有序Logistic 回歸通過了平行線檢驗（P=0.240），表明以上統計結果準確可靠。

2.4 GSTP1 和ALDH3A1 基因多態性與CTX 不良反應的相關性

65 例患者在1 年治療觀察期內，有12 例（占18.5%）出現肝功能異常；24 例（占36.9%）發生感染性疾病，其中13 例（占20.0%）發生呼吸道感染，13例（占20.0%）發生泌尿系感染，未發現有嚴重胃腸道反應和骨髓抑制其他不良反應。GSTP1 rs1695、ALDH3A1 rs2228100 位點的基因多態性與肝損傷或感染等不良反應之間無顯著相關性。

3 討論

在本研究中，CTX 聯合糖皮質激素方案治療IMN 患者12 個月時的總體緩解率達78.5%，其中完全緩解率為41.5%，部分緩解率為36.9%。

最近，Fernández-Juárez G 等[5]研究比較了糖皮質激素和CTX 的循環交替治療方案與他克莫司和利妥昔單抗的序貫治療方案、用于原發性膜性腎病誘導和維持治療的有效性。結果顯示，糖皮質激素和CTX 組在12 個月和24 個月時的總體緩解率（含完全緩解和部分緩解）分別為79.1%和83.7%，完全緩解率分別為32.6%和60.5%，均明顯高于他克莫司和利妥昔單抗組。另一納入21 項研究（1187 例）的薈萃分析顯示，CTX 組在治療6 個月和12 個月時的總體緩解率分別為64.7%和77.4%，6 個月時的緩解率低于鈣調磷酸酶抑制劑（CNIs）組，但12 個月時的緩解率與CNIs 組無顯著差異[6]。以上文獻中CTX 方案的總體緩解率與本研究的結果較為一致。

單因素分析顯示，性別對療效存在顯著性影響，多因素分析進一步證實男性是12 個月疾病緩解率的獨立危險因素，即男性的疾病緩解率明顯低于女性。其他研究也顯示，性別（男性）、年齡、起病時腎小球濾過率（GFR）下降、低分子量生物標記物（如β2微球蛋白）分泌增加、治療后磷脂酶A2 受體抗體（anti-PLA2R）水平持續升高，以及腎臟病理C3染色陽性是膜性腎病腎功能進展的危險因素[1]。Choi JY 等[7]篩選出的膜性腎病預后良好的預測因子包括起病時較高的血紅蛋白（HR:0.82，95%CI：0.72～0.93），較高的血清白蛋白水平（HR:0.66，95%CI：0.44～0.99）以及較高的GFR 值（HR:0.96，95%CI：0.95～0.97）。

CTX 是一種前藥，進入體內后經細胞色素CYP 2B6、2C9、2C19 等代謝酶轉化為4-羥基環磷酰胺（4-OH-CTX），然后開環生成醛磷酰胺，兩者處于相互轉化的動態平衡中，最終轉化為烷化劑磷酰胺氮芥和丙烯醛。4-OH-CTX 通過GSTM1/GSTP1/GSTT1 催化進一步與細胞內谷胱甘肽結合，生成無毒的水溶性復合物由尿液排出。醛磷酰胺可通過ALDH1A1和ALDH3A1 氧化生成為羧磷酰胺（CEPM）。因此，GST 和ALDH 的活性對CTX 的療效和毒性反應具有非常重要的影響。

一項采用標準CTX 方案治療不同自身免疫性疾病的研究顯示[8]，GSTP1 I105V（rs1695）野生型（AA 型）的治療有效率為21.42%，雜合子（AG 型）和純合子（GG 型）的治療有效率分別為61.53%和50.00%，野生型和突變型的療效差異具有統計學意義（P=0.03）。其機制為GSTP1 突變型為弱代謝型，酶活性下降，導致CTX 活性代謝產物治療濃度更高、作用維持時間更長，因此患者的治療反應更佳。另有一項對乳腺癌和其他癌癥患者的研究，其報道了GSTP1 I105V 基因多態性與CTX 為基礎的方案的治療反應之間有相關性，突變型（包括雜合子和純合子）患者總體生存率更高及復發率更低[9]。

然而，也有部分研究得出了不同的結論。Wang HN 等[10]發現GSTP1 rs1695 基因型對狼瘡性腎炎患者的療效無顯著影響（P=0.31）；但GSTA1*A 雜合子（CT 型）相對于野生型（CC 型）CTX 治療后疾病不緩解的風險更大（P=0.005），原因是CTX 活性代謝產物（4-OH-CTX）體內暴露量低[AUC4OH-CTX：12.8（9.8，19.5）vs27.5（18.1，32.8）h·mg·L-1，P=0.023]。

Audemard-Verger A 等[11]在采用CTX 方案治療狼瘡性腎炎中探討了GSTP 基因多態性對預后的影響，發現GSTP1 C313A（野生型）和C313A＞G（純合子和雜合子）的總體緩解率分別為91.2%和72.4%（P=0.059），在多因素分析中，GSTP1 C313A＞G 是總體緩解率低的獨立影響因子，OR 95%CI 為5.011（1.025～24.510），P=0.047。該研究推測的作用機制為GSTP1 主要表達在腎臟而非肝臟，即GSTP1 并不是參與CTX 代謝主要的關鍵酶，其突變型較低的緩解率是與腎臟的解毒作用有所降低有關。

基因多態性對CTX 藥物不良反應的影響方面，陳玲燕等[12]研究發現，在相同劑量下，ALDH3A1 rs2228100 突變純合子（GG）患者用CTX 后出現肝功能異常的風險顯著高于CC/GC 患者OR 95%CI為20.59（2.26～187.96）。在本研究中，ALDH3A1 GG型肝損傷發生率約為CC 型的2 倍（16.7%vs7.7%），但無統計學差異，可能與研究方案中CTX 治療劑量偏低以及樣本量偏小有關，也未發現CTX 導致骨髓抑制和出血性膀胱炎的病例。

本研究的單因素分析結果顯示，GSTP1 rs1695基因型對療效存在一定影響，但多因素分析中未顯示其為獨立影響因素，可能與本研究的樣本量較小有關，需要擴大樣本量來進一步驗證和探究，而ALDH3A1 rs2228100 基因型對療效與不良反應無顯著影響。