LC-MS/MS 法測定鹽酸莫西沙星中酰氯類遺傳毒性雜質

曹 穎，朱 飛，霍立茹，*

1 徐州醫科大學，徐州 221000；2 南京濟群醫藥科技股份有限公司，南京 211100

莫西沙星作為第四代喹諾酮類抗菌藥，臨床應用為鹽酸鹽的形式。其在前三代藥物的基礎上進行了結構修飾，具有抗菌譜廣、抗菌能力強、療效好、不良反應少等優點，因此在臨床得到廣泛的應用[1]。在鹽酸莫西沙星合成工藝中用到了2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯，此為潛在遺傳毒性雜質[2]。該類雜質在極微量的水平就能誘導DNA 發生突變，嚴重威脅人類的健康，因此有必要建立鹽酸莫西沙星中2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯的檢測方法。

酰氯類化合物的性質非常活潑，原型結構不易直接檢測[3]，目前文獻報道中多采用衍生化法對酰氯進行測定[4-9]。主要有水解法和醇解法，使酰氯結構轉化為相應的羧酸和酯進行檢測；但是醇解法對反應體系中的含水量要求較高，必須嚴格控制操作環境以及樣品中的水分，檢測比較復雜。此外，根據EMA、美國FDA 以及ICH M7[10-12]中相關指導原則要求，遺傳毒性雜質的毒理學關注閾值（TTC）為1.5 μg/天。莫西沙星制劑一般日最大使用劑量為400 mg，所以鹽酸莫西沙星中2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯的限度為3.75 ppm，限度很低，普通的液相色譜方法達不到靈敏度要求，目前尚未見到鹽酸莫西沙星中酰氯類遺傳毒性雜質研究的相關報道。

本文采用LC-MS/MS 法，以水解法對2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯進行衍生化后測定，操作簡單，不僅滿足了遺傳毒性雜質痕量研究中的高靈敏度要求，也解決了酰氯結構的不穩定性對測定帶來的影響，同時也為其他酰氯類物質的檢測提供參考。

1 材 料

1.1 儀器

U3000 高效液相色譜儀（Thermo-Fisher)；API 4000 三重四級桿質譜儀（AB Sciex）；CPA225D 電子分析天平（精度：0.01 mg），賽多利斯；MSA6.6S 電子分析天平（精度：0.001 mg），賽多利斯。

1.2 藥品與試劑

2，4，5-三 氟-3-甲氧基苯甲酰氯（批號：1772231M-SY-01，純度：97.9%）（深圳市斯坦德華工科技有限公司）；鹽酸莫西沙星原料藥（批號：MX1712001、MX1712002、MX1712003）（南京濟群醫藥科技股份有限公司）。

甲酸（批號：6F2941）（ROE）；甲醇（批號：I0887507717，Merck）為色譜級；乙腈（批號：1823829614，Merck）為質譜級。試驗水為重蒸水。

2 方法與結果

2.1 液相色譜-質譜條件

2.1.1 液相色譜條件 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相：乙腈-0.1%甲酸（75∶25）；柱溫：40 ℃；流速：0.2 mL·min-1；進樣量：5 μL；分析時間：5 min。

2.1.2 質譜條件 選用電噴霧離子源（ESI），設定源參數分別為：噴霧電壓-4200 V，輔助氣150 Pa，輔助氣250 Pa，輔助氣加熱溫度450 ℃，氣簾氣20 Pa，碰撞氣1 Pa。

設定Q0 入口電壓為-10V，Q2 出口電壓為-15V。負離子檢測模式，MRM：205.0/160.8，去簇電壓為-30 V，碰撞電壓為-14 eV。

2.2 衍生化條件

將水作為衍生化試劑，取鹽酸莫西沙星約20mg，置10 mL 量瓶中，加1 mL 水使溶解，室溫條件下超聲5 min，將鹽酸莫西沙星中可能存在的2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯轉化為性質更穩定的2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酸來進行測定。

2.3 溶液配制及檢測

取2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯約1 mg，精密稱定，置10 mL 量瓶中，加水溶解超聲振蕩5 min并稀釋至刻度，作為對照品貯備液；精密量取對照品貯備液適量，加甲醇逐級稀釋成2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯的濃度約為0.5、1、2、5、10、20 ng·mL-1的系列溶液，作為標準溶液。

取鹽酸莫西沙星原料藥約20 mg，置10 mL 量瓶，加1 mL 水，室溫條件下超聲振蕩5 min，再用甲醇稀釋至刻度，作為供試品溶液。

精密量取標準溶液與供試品溶液各5 μL，分別進樣測定，按標準曲線法計算含量。

2.4 分析方法驗證

2.4.1 質譜分析 負離子模式下在2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯水解衍生物（2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酸）準分子離子峰（M-H-）為m/z=205.0，在其二級裂解質譜圖中，豐度最強的子離子峰為m/z=160.8，為2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酸脫去羧基（-COOH）所形成的，裂解質譜圖見圖1。

圖1 2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酸m/z=160.8 的二級裂解質譜圖

2.4.2 專屬性試驗 在所建立的色譜和質譜條件下，2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯的水解衍生物2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酸的保留時間為0.99min，空白溶劑在此處無峰檢出，對2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯的測定無干擾，表明方法專屬性良好。見圖2。

圖2 專屬性試驗圖譜

2.4.3 定量限與檢測限設立 取上述“2.3”項下對照品貯備液適量，加甲醇逐級稀釋成一定濃度的溶液，分別以信噪比S∶N=10∶1 及3∶1 時的濃度作為定量限及檢測限，結果該方法下2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯的定量限濃度為0.40 ng·mL-1（相當于供試品濃度的百分比為0.20 ppm）；檢測限濃度為0.080 ng·mL-1（相當于供試品濃度的百分比為0.04 ppm），這表明2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯的定量限濃度明顯低于限度濃度（3.75 ppm），方法靈敏度符合要求。

2.4.4 線性與范圍 精密量取“2.3”項下對照品貯備液適量，加甲醇稀釋成濃度分別為0.485、3.856、4.627、7.712、11.569、15.425 ng·mL-1的系列溶液，取各溶液5 μL，按“2.1”項下液質條件進樣，以2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯的濃度C（ng·mL-1）為橫坐標（X），2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酸的峰面積A為縱坐標（Y），進行線性回歸。回歸方程為：Y=3.82×104X-1.439×103，r=0.999 9，這表明2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯在0.485～15.425 ng·mL-1濃度范圍內，線性關系良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密量取“2.3”項下對照品貯備液適量，加甲醇逐級稀釋成濃度約為75 ng·mL-1的溶液，作為回收率外加對照品貯備液。另取鹽酸莫西沙星原料約20 mg，置10 mL 量瓶中，平行配制3 份，分別加1 mL 水超聲使溶解，再分別精密量取對照品貯備液0.5、1.0、1.5 mL，置上述10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，平行配制3 份。分別精密量取各溶液5 μL 進樣，按“2.1”項下液質條件檢測。結果表明，2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯回收率在101.6%～111.2%，RSD 為3.7%，符合要求。見表1。

表1 回收率試驗結果

2.4.6 進樣精密度試驗 精密量取濃度約為75 ng·mL-1的回收率外加對照品貯備液5 μL，按“2.1”項下液質條件檢測，連續進樣6 次，記錄峰面積，結果2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯水解物峰面積的RSD 為2.1%（n=6），表明儀器進樣精密度良好。

2.4.7 重復性試驗 按“2.3”項下方法，平行配制6份供試品溶液。按“2.1”項下液質條件檢測，結果6份樣品均未檢出雜質。

另配制含2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯約7.5 ng·mL-1的供試品溶液6 份，按“2.1”項下液質檢測，以含量結果的RSD 作為評價指標。6 份樣品的含量均為0.0004%，RSD 為3.0%，表明方法重復性符合要求。

2.5 樣品雜質檢測

取鹽酸莫西沙星原料藥3 批，按照“2.3”項下方法配制供試品溶液，按“2.1”項下液質條件分別進樣測定，記錄峰面積，按標準曲線法計算酰氯殘留量。結果3 批原料藥中均未檢出2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯。

3 討論

3.1 衍生化時間和溫度的考察

采用水解法對酰氯進行衍生化，以水超聲溶解樣品的方式使酰氯結構水解成羧酸進行檢測。考察了不同溫度（20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃）對衍生化反應的影響，以回收率為指標來考察酰氯是否完全轉化為相應的羧酸，結果表明，溫度對衍生化反應幾乎沒有影響，故選擇在室溫條件下進行衍生化反應。

在室溫條件下，考察了反應時間（3、5、7、10、15 min），同樣以回收率作為考察指標。結果表明一般室溫條件下超聲3～15 min 該酰氯雜質均能水解完全。為了實驗操作的方便性，選擇室溫條件下超聲5 min 作為衍生化的條件

3.2 液相色譜條件的確定

考察了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液和甲醇-0.1%甲酸水溶液等不同的流動相組成，以及有機相比例（50%、60%、75%），結果發現，75%乙腈時的雜質響應和峰形較好，流動相中加入甲酸對峰形有改善作用且未對離子化效率產生不利影響，有機相的比例提高也有利于離子化效率的提高，從而得到更高的靈敏度。故選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液（75∶25）作為流動相。

在進行回收率試驗時，供試品溶液直接全部以水做溶劑時，因離子化效率低導致回收率偏低，采用先加適量水超聲溶解后，再以甲醇稀釋至所需濃度的方式，離子化效率明顯提高。

綜上，本方法能夠對鹽酸莫西沙星中的酰氯類遺傳毒性雜質進行準確測定，方法專屬性強，靈敏度高，能滿足遺傳毒性雜質痕量研究的要求，可作為鹽酸莫西沙星中的酰氯類雜質的質量控制方法。