UPLC-Q/TOF-MS 法測定虎杖中虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素在高脂血癥鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)*

王 敏，王 晶，楊 娜，柳 航，朱懷軍**

1 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院 藥學(xué)部，南京 210008；2 南京臨床藥學(xué)中心，南京 210008；3 陜西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，咸陽 712046

高脂血癥是人體脂肪代謝或轉(zhuǎn)運異常，造成血漿中總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）水平高于和/或高密度脂蛋白水平低于正常水平的一種全身性代謝疾病。多項研究[1，2]顯示，高脂血癥是多種心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)和主要獨立危險因素。故近年來高脂血癥的防治逐漸受到醫(yī)學(xué)界的重視和關(guān)注，成為心血管領(lǐng)域的研究熱點之一。

虎杖系蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum-Sieb.et Zucc.的根和根莖[3]，有清熱解毒、散瘀止痛、利濕化痰之功效，該藥調(diào)脂藥效與辛伐他汀相似，且無明顯毒副作用[4]。已有研究報告，虎杖中指標性成分虎杖苷[5]、白藜蘆醇[6]、大黃素[7]具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用。同時，越來越多的研究顯示，機體生理病理狀態(tài)對體內(nèi)成分的藥代動力學(xué)行為具有一定的影響。因此，開展中藥多指標性成分在病理狀態(tài)下的藥代動力學(xué)[8]研究，對于揭示中藥物質(zhì)基礎(chǔ)、闡明作用機制以及深入開發(fā)具有重要的意義。

目前，關(guān)于虎杖的藥代動力學(xué)研究集中在虎杖苷、白藜蘆醇和大黃素的單一或某兩個成分[9-12]，而3 個成分的同時定量分析未見報道。此外，現(xiàn)有研究多關(guān)注虎杖指標性成分在正常動物體內(nèi)的代謝動力學(xué)特征，關(guān)于其在高脂血癥模型鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究鮮有報道。

基于此，現(xiàn)借助超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜法（u1tra-performance 1iquid chromatography-quadrupo1e/time-of-f1ight mass spectrometry，UPLC-Q/TOF-MS）的高分辨多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式（high -reso1ution mu1tip1e reaction monitoring，MRMHR），建立血漿中虎杖指標性成分虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素同時定量分析方法，并應(yīng)用該方法開展虎杖提取物在高脂血癥模型鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究，探究虎杖指標性成分的藥動學(xué)特征，為虎杖物質(zhì)基礎(chǔ)的體內(nèi)過程分析提供參考，為虎杖藥用資源的深入開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 儀器與藥品試劑

1.1 儀器

Shimadzu ExionLC AD 型超快速高效液相色譜儀；AB SCIEX TripleTOF 5600+型高分辨質(zhì)譜儀；Eppendorf 5417R 型高速冷凍離心機；Scientific Industries VORTEX-GENIE2 型旋渦混合器；Thermo FisherSpeedVac 離心濃縮儀。

1.2 藥品與試劑

對照品：虎杖苷（批號CHB190103）、白藜蘆醇（批號CHB180228）、大黃素（批號CHB181208）均購自成都克洛瑪生物科技有限公司；內(nèi)標雙氯芬酸鈉（批號100334-201803）購自中國食品藥品檢定研究院。虎杖藥材購自甘肅康寧醫(yī)藥科技有限責任公司（批號：1903010），經(jīng)副主任中藥師柳航鑒定為蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的根和根莖。乙腈為色譜級、甲酸為分析純、水為超純水。

1.3 實驗動物

敘利亞金黃地鼠，雄性若干只，體重110～130 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司（SCXK（京）2016-0011）提供。

2 方 法

2.1 色譜條件

采用0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）二元梯度洗脫系統(tǒng)，經(jīng)waters ACQUITY UPLC BEH C18（1.7μm，2.1mm×100mm）色譜柱分離；流速為0.2mL·min-1；柱溫為40 ℃；進樣體積5 μL。

梯度洗脫為：0.0～3.0 min，90%～20%A，每次進樣前以流動相初始條件90%A 預(yù)平衡2 min。

2.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源（ESI）進行離子化，在負離子模式下進行MRMHR 檢測，霧化氣和輔助加熱氣均為345 kPa，氣簾氣為207 kPa，噴霧電壓為-4500 V，離子源溫度為550 ℃。

虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素和內(nèi)標的高分辨率多反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)見表1。

表1 虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素和內(nèi)標的MRMHR 檢測參數(shù)

2.3 實驗方案

參考課題組前期方案[13]構(gòu)建高脂血癥動物模型，金黃地鼠給予普通飼料喂養(yǎng)1 周以適應(yīng)環(huán)境。1周后根據(jù)體重隨機分為兩組：正常組和高脂組。正常組保持正常飲食；高脂組給予高脂飼料（10%w/w 椰子油、0.5%膽固醇），2 周后禁食12 h，分別從眼底靜脈叢取血約1 mL，置于肝素化的塑料離心管中，5000 r·min-1離心分取血漿，測定血脂膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C），以確證造模是否成功。造模成功后，6 只高脂模型大鼠，以2.0 g·kg-1（以藥材計）給予虎杖灌胃液，給藥前禁食12 h。分別于給藥前及給藥后0.083、0.167、0.25、0.33、0.5、0.75、1、1.5、2、3、5、8、12、24 h 經(jīng)眼底靜脈叢取血0.1 mL，置肝素鈉浸潤的離心管中，4000 r·min-1離心10 min，分離血漿，置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 樣品前處理

精密吸取血漿40 μL，依次加入2 μg·mL-1內(nèi)標標準溶液2 μL 和乙酸乙酯1.0 mL，渦旋混勻5 min，4000 r·min-1離心10 min，取上清液900 μL，于37 ℃真空濃縮，揮干溶劑。固體物以40 μL 乙腈-0.1%甲酸水溶液（80∶20，v/v）渦旋30 s 溶解，14000 r·min-1離心10 min 后，取上清液供儀器分析。

2.5 藥材及對照品制備

稱取虎杖飲片25 g，加水500 mL，浸漬1 h，加熱至沸，保持微沸2 h，趁熱用紗布過濾，濾液經(jīng)冷凍干燥得固體物4.5 g。在虎杖凍干粉中，虎杖苷、白藜蘆醇和大黃素的含量分別為3.57%、1.01%和0.62%（以原藥材計）。

按《中國藥典》2020 年版規(guī)定，成人最大日劑量為15 g，根據(jù)實驗動物與人（成人以60 kg 體重計）按體表面積比折算等效劑量的換算關(guān)系，得出金黃地鼠的等效劑量為2.0g（虎杖藥材）/kg（體重）。采用0.5%羥甲基纖維素鈉溶液懸浮虎杖凍干粉，配制灌胃液，含虎杖凍干粉36mg·mL-1，即虎杖藥材0.2g·mL-1。

分別精密稱取虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素對照品和內(nèi)標適量，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解，定容配制成1.0 mg·mL-1對照品貯備液；使用時再精確稀釋至所需濃度的對照品溶液。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)驗證

根據(jù)NMPA 和FDA 有關(guān)生物樣品分析方法驗證的相關(guān)指導(dǎo)原則，對所建立的高脂血癥模型鼠血中虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素3 個成分以UPLC-Q/TOF-MS法進行檢測，從專屬性、線性、精密度、回收率及穩(wěn)定性等方面進行方法學(xué)驗證。LLOQ、低、中、高濃度水平質(zhì)控樣本中虎杖苷的濃度分別為1、2、80、800ng·mL-1，白藜蘆醇和大黃素濃度為0.5、1、40、400ng·mL-1。

3.1.1 專屬性考察 將6 份來自不同個體的高脂血癥模型鼠的空白血漿、空白血漿加入虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素和內(nèi)標，以及高脂血癥模型鼠灌服虎杖后的血漿樣品，按照“2.4”血漿樣品處理方法處理后，分別進行UPLC-Q/TOF-MS 分析，所得典型色譜圖見圖1。由圖1 可見，虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素和內(nèi)標的保留時間分別為1.16、1.43、2.47 和2.29 min，且在各成分保留時間處未見干擾，提示血漿中其他成分不影響虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素和內(nèi)標的專屬性和特異性檢測。

圖1 高脂血癥模型鼠血漿中虎杖指標性成分和內(nèi)標的典型色譜圖

3.1.2 標準曲線 分別精密吸取混合對照品溶液適量，真空揮干后加入空白高脂血漿40 μL，渦旋混勻，配制成含虎杖苷濃度為1、4、10、20、100、200、500、1000 ng·mL-1，以及白藜蘆醇和大黃素濃度為0.5、1、2、5、10、50、100、250、500 ng·mL-1的血漿樣品，按“2.4”血漿樣品處理方法處理，并進行UPLCQ/TOF-MS 分析，記錄各成分色譜峰峰面積（As）與相應(yīng)內(nèi)標色譜峰峰面積（Ar）。重復(fù)多次，以色譜峰峰面積比值R（R=As/Ar）對濃度（C，ng·mL-1）進行線性回歸，得各成分的回歸方程，見表2。

表2 指標性成分標準曲線

結(jié)果表明，虎杖苷血藥濃度在1～1000 ng·mL-1、白藜蘆醇和大黃素的血藥濃度在0.5～500 ng·mL-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系均良好，r 值均在0.9978 以上。

3.1.3 精密度和準確度 按標準曲線測定方法配制同時含虎杖苷、白藜蘆醇和大黃素LLOQ 及低、中、高3 種濃度的血漿樣本，按“2.4”血漿樣品處理方法處理。在一個分析批內(nèi)測定5 次，計算批內(nèi)精密度；連續(xù)3 天配制并測定3 個分析批，計算批間精密度，結(jié)果見表3。

表3 高脂血癥模型鼠血漿中虎杖指標性成分的精密度和準確度

3 個待測成分的批內(nèi)和批間精密度RSD（%）均＜15%，準確度在-6.9%～7.8%，提示該方法精密度和準確度均良好。

3.1.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 按標準曲線測定方法配制含虎杖苷、白藜蘆醇和大黃素低、中、高3種濃度的血漿樣本各6 份，按“2.4”方法處理血漿樣本，記錄各待測成分峰面積A1和內(nèi)標峰面積AIS1，并計算峰面積比值R1（R1=A1/AIS1）。另取空白血漿40 μL，經(jīng)乙酸乙酯萃取離心后，在獲得的上清液中加入相應(yīng)低、中、高3 種濃度的混合對照品溶液和內(nèi)標，于37 ℃真空濃縮，揮干溶劑。固體物以40 μL乙腈-0.1%甲酸水溶液（80∶20，v/v）渦旋30 s 溶解，14000 r·min-1離心10 min，取上清液供儀器分析，進樣記錄各待測成分峰面積A2和內(nèi)標峰面積AIS2，并計算峰面積比值R2（R2=A2/AIS2）。另取上述低、中、高3 種濃度的混合對照品溶液和內(nèi)標，于37 ℃真空濃縮，揮干溶劑。固體物以40μL 乙腈-0.1%甲酸水溶液（80∶20，v/v）渦旋30s 溶解，14000r·min-1離心10min后，取上清液供儀器分析，進樣記錄各待測成分峰面積A3和內(nèi)標峰面積AIS3，并計算峰面積比值R3（R3=A3/AIS3）。

提取回收率=R1/R2（mean）

內(nèi)標歸一化基質(zhì)因子=R2/R3（mean）

結(jié)果見表4，各待測成分低、中、高3 種濃度的平均回收率均＞80%且穩(wěn)定，內(nèi)標歸一化基質(zhì)因子在90.1%～105.8%，RSD＜15%，符合生物樣本檢定的要求。

表4 高脂血癥模型鼠血漿中虎杖指標性成分和內(nèi)標的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)（n=6）

3.1.5 穩(wěn)定性試驗 取含虎杖苷、白藜蘆醇和大黃素的低、中、高3 種濃度的質(zhì)控樣本，分別在室溫下放置12 h、-80 ℃冰箱保存1 個月和反復(fù)凍融3 個循環(huán)，考察其穩(wěn)定性。低、中、高3 種濃度質(zhì)控樣本按“2.4”項下方法處理后，放置于進樣器中24 h，考察樣本進樣器放置穩(wěn)定性。結(jié)果見表5。低、中、高3 種濃度的質(zhì)控樣本的精密度（RSD）和準確度（RE）均在±15%內(nèi)，表明在考察的存儲條件下樣本均穩(wěn)定。

表5 高脂血癥模型鼠血漿中虎杖指標性成分的穩(wěn)定性

3.2 藥代動力學(xué)結(jié)果

高脂血癥模型鼠灌服虎杖提取物后，應(yīng)用所建立的UPLC-Q/TOF-MS 法測定模型鼠體內(nèi)虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素的血藥濃度，平均血藥濃度-時間曲線見圖2。

圖2 高脂血癥模型鼠血漿中虎杖指標性成分的血藥濃度-時間曲線（n=6）

采用DAS 2.0 處理軟件（中國藥理學(xué)會）的非房室模型（統(tǒng)計矩法）估算藥代動力學(xué)參數(shù)，包括AUC0～24h、AUC0-∞、MRT0-∞、t1/2，血藥濃度的達峰時間（Tmax）和最大血藥濃度（Cmax）為實測值，結(jié)果見表6。

表6 虎杖指標性成分在高脂血癥模型鼠體內(nèi)主要藥代動力學(xué)參數(shù)（n=6）

4 討論

中藥藥代動力學(xué)是借用化學(xué)藥物代謝動力學(xué)研究手段，研究中藥活性成分、組分、單味中藥和復(fù)方在機體內(nèi)的過程及其動態(tài)變化規(guī)律，以探討中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、中藥組分的相互作用、中藥配伍機制和中藥炮制機理等科學(xué)問題[14]。由于靈敏度高和專屬性強，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法廣泛用于中藥多成分的定量分析和藥代動力學(xué)研究[15]。近年來，隨著液相色譜質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，高分辨質(zhì)譜也被應(yīng)用于多成分的定量。高分辨質(zhì)譜特有的MRMHR 模式，不僅具有超高質(zhì)量分辨率，也具有低分辨質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測模式的準確度和靈敏度[16，17]。

本研究基于UPLC-Q/TOF-MS 法的MRMHR模式，建立虎杖中虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素的血藥濃度分析方法，該方法具有分析時間短、專屬性好和靈敏度高等特點。

在血漿樣本前處理過程中，分別考察甄選甲醇、乙腈、乙酸乙酯和甲基叔丁基醚為提取試劑。蛋白沉淀法前處理快速便捷，但其選擇性差，血漿中內(nèi)源性基質(zhì)可能影響待測成分的檢測。液-液萃取法根據(jù)相似相溶原理，選擇性好，可以去除大部分內(nèi)源性基質(zhì)的干擾，當溶劑揮干后可以達到富集待測物的目的。研究發(fā)現(xiàn)，甲基叔丁基醚對虎杖苷和白藜蘆醇萃取效率不足70%，而乙酸乙酯對3 種待測物的萃取效率均可達到80%以上。本研究最終確定以乙酸乙酯液萃取。

虎杖調(diào)脂藥效明確，研究其指標性成分虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素在疾病狀態(tài)下的藥代動力學(xué)特征，對于進一步揭示其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制具有重要的意義。本研究建立的UPLC-Q/TOF-MS法同時檢測高脂血癥模型鼠灌服虎杖提取物后3種指標性成分的血藥濃度。鑒于非房室模型限制性條件較少，只要求藥物末端符合指數(shù)消除，不受房室模型的限制，適用于大多數(shù)藥物[18]，因此選用非房室模式估算藥代動力學(xué)參數(shù)。研究結(jié)果顯示，高脂血癥模型鼠灌服虎杖提取物后，3 種指標性成分可快速達到血藥濃度峰值，平均達峰時間約為15 min。血藥濃度-時間曲線顯示，大黃素藥-時曲線呈現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，這與文獻報道一致[19]。肝腸循環(huán)是導(dǎo)致大黃素雙峰現(xiàn)象的主要原因。在3 種指標性成分中，虎杖苷血藥濃度最高，體內(nèi)暴露量大，而大黃素血藥濃度則相對偏低，體內(nèi)暴露量亦較小。從反映藥物在體內(nèi)消除快慢和速率的參數(shù)t1/2和MRT 可知，虎杖指標性成分在高脂血癥模型鼠體內(nèi)消除較快。

綜上所述，本研究基于UPLC-Q/TOF-MS 法的MRMHR 模式，建立了同時測定虎杖中虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素血藥濃度的分析方法，并采用該方法初步探討了高脂血癥大鼠灌服虎杖提取物后3 種指標性成分的藥代動力學(xué)特征，為進一步開展虎杖治療高脂血癥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和機制研究提供理論基礎(chǔ)，為虎杖藥用資源的深入開發(fā)提供依據(jù)。