水稻黑條矮縮病株不同分蘗內(nèi)病毒含量分析

王海濤，宛柏杰，董 巖，王 滿，徐秋芳,3，周益軍

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，江蘇 南京 210014；2.江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 鹽城 224002；3.江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究所，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

水稻黑條矮縮病是由呼腸孤病毒科（Reoviridae）斐濟(jì)病毒屬（Fijivirus）中的成員水稻黑條矮縮病毒（rice black-streaked dwarf virus,RBSDV）侵染引起的一種病害[1-3]。RBSDV除可侵染水稻外，還可以侵染小麥、玉米、大麥、燕麥和高粱等禾本科作物，是制約東亞地區(qū)糧食生產(chǎn)的重要植物病毒[1,3]。RBSDV基因組由10條線性雙鏈RNA組成，可編碼6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白[4]。其中，由基因S10編碼的P10是病毒主要的外層衣殼蛋白[5]。RBSDV主要由介體灰飛虱（Laodelphax striatellusFallén）以持久性、增殖型的方式進(jìn)行傳播，侵染引起水稻植株矮縮、葉片濃綠僵直、不抽穗或穗小，在葉背和莖基部有白色至褐色瘤狀突起[1]。

由病原微生物侵染引起的植物體內(nèi)激素的變化，可以促進(jìn)或抑制病原物對(duì)植物的侵染，使植物表現(xiàn)出更為嚴(yán)重或變輕的病癥[6-7]。水稻受病毒侵染后通常表現(xiàn)為植株矮小，但仍可進(jìn)行分蘗，可能與水稻體內(nèi)激素水平的改變有關(guān)。目前，關(guān)于RBSDV侵染水稻后如何調(diào)控植株內(nèi)源激素相關(guān)的信號(hào)通路，進(jìn)而影響其侵染的報(bào)道已較為詳細(xì)，如：RBSDV的侵染可以激活水稻茉莉酸（jasmonic acid，JA）信號(hào)通路，抑制其油菜素內(nèi)酯（brassinosteroids，BRs）途徑，進(jìn)而抑制病毒對(duì)水稻的侵染[8]；RBSDV侵染水稻后引起脫落酸（abscisic acid，ABA）含量的增加，進(jìn)而通過(guò)抑制JA信號(hào)途徑調(diào)節(jié)水稻內(nèi)活性氧水平來(lái)負(fù)調(diào)控水稻對(duì)RBSDV的防御[9-10]；抑制生長(zhǎng)素（auxin）信號(hào)，可以促進(jìn)水稻對(duì)RBSDV的敏感性，導(dǎo)致更為嚴(yán)重矮化的癥狀[11]；等等。然而目前仍有一些基礎(chǔ)問(wèn)題尚不明確，如關(guān)于水稻黑條矮縮病毒在水稻不同分蘗內(nèi)的絕對(duì)含量仍不清楚。此外，病株不同分蘗上介體灰飛虱的獲毒性差異亦不明確。為此，本研究擬測(cè)定水稻黑條矮縮病株中不同分蘗內(nèi)及根部的病毒含量，旨在更進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)RBSDV侵染水稻的認(rèn)識(shí)，為研究因病毒侵染而引起的植物生理學(xué)上的變化奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

灰飛虱采集自江蘇省海安市水稻田（119.02°E、33.62°N），經(jīng)篩選后長(zhǎng)期飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室。RBSDV水稻病株由帶毒灰飛虱傳毒獲得，長(zhǎng)期保存于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保所實(shí)驗(yàn)室。接種水稻為遲熟中粳淮稻5號(hào)，該品種高感水稻黑條矮縮病。灰飛虱常規(guī)飼養(yǎng)選用遲熟中粳武育粳3號(hào)水稻苗。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 灰飛虱的飼毒及傳毒。將2齡期無(wú)毒灰飛虱若蟲(chóng)在清洗干凈的RBSDV水稻上飼喂2 d，后轉(zhuǎn)移至健康無(wú)毒的武育粳3號(hào)水稻苗上飼養(yǎng)12 d，隨后采用Elisa方法對(duì)灰飛虱帶毒率進(jìn)行檢測(cè)。按每棵苗2頭的有效接種蟲(chóng)量，將體內(nèi)RBSDV度過(guò)循回期的灰飛虱接種到淮稻5號(hào)幼苗上。以無(wú)毒灰飛虱接種淮稻5號(hào)作為對(duì)照處理。接種3 d后，將水稻苗種植于田間水泥池內(nèi)，記錄種植日期，噴施吡蟲(chóng)啉，覆蓋防蟲(chóng)網(wǎng)。

1.2.2 總RNA的提取。接種RBSDV 40 d后，取RBSDV侵染的水稻病株5株，根據(jù)分蘗數(shù)量，莖葉部 分 別 標(biāo) 記 為RB1-L1至RB1-L5、RB2-L1至RB2-L6、RB3-L1至RB3-L5、RB4-L1至RB4-L5、RB5-L1至RB5-L5；根部分別對(duì)應(yīng)標(biāo)記為RB1-R、RB2-R、RB3-R、RB4-R和RB5-R。根據(jù)TaKaRa公司RNAiso Plus（9109）試劑說(shuō)明書(shū)提取樣品總RNA，利用NanoDrop 2000（Eppendorf）分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 cDNA的合成及熒光定量PCR。參照TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑（RR047A）使用說(shuō)明書(shū)合成水稻及灰飛虱cDNA。設(shè)計(jì)RBSDV外殼蛋白P10基因部分序列PCR引物（F端引物：CATTGTCAAATCGCCCCACG，R端引物：TACCGCGCTCCAAGTTTGTT）對(duì)RBSDV毒株帶毒率進(jìn)行分析。以RBSDV水稻不同分蘗的cDNA為模板，利用RBSDV-P10定量特異性PCR引物[12]（F端引物：GCCCCACGTTGCATCTTC，R端引物：TGTTGGGCAAAGTGCTAGTTTC），參照TaKaRa公司熒光定量試劑（RR066A）說(shuō)明書(shū)，配制20μL反應(yīng)體系，在IQTM5熒光定量PCR儀內(nèi)進(jìn)行3步法PCR反應(yīng)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本研究所有數(shù)據(jù)均利用SPSS 19.0進(jìn)行分析。多組數(shù)據(jù)間采用單因素方差分析，2組數(shù)據(jù)間采用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異性統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻黑條矮縮病株的分蘗數(shù)

將接種了RBSDV的淮稻5號(hào)水稻種植于田間水泥池內(nèi)，40 d后各取5株無(wú)毒灰飛虱接種的水稻及表現(xiàn)出典型RBSDV病害癥狀的水稻（圖1-A），利用RBSDV特異性引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，在表現(xiàn)出典型RBSDV病害癥狀的水稻內(nèi)可以檢測(cè)到1條清晰的條帶，表明RBSDV成功侵染水稻（圖1-B）。

圖1 RBSDV侵染水稻后的癥狀及PCR檢測(cè)

接著，對(duì)RBSDV侵染40 d后水稻的分蘗數(shù)進(jìn)行分析，每組3株，各處理取5組。t檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，RBSDV侵染后水稻分蘗數(shù)沒(méi)有顯著性差異（表1），表明RBSDV侵染后對(duì)水稻的分蘗數(shù)無(wú)影響。

表1 相同生育期內(nèi)健康水稻和RBSDV水稻分蘗數(shù)

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

為明確水稻黑條矮縮病株中不同分蘗內(nèi)病毒的絕對(duì)含量，本研究首先將RBSDV外殼蛋白P10基因的開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）克隆至pEASY-Blunt Zero載體（全式金公司），篩選后將陽(yáng)性克隆送至生物公司測(cè)序，取測(cè)序正確、無(wú)突變的質(zhì)粒（質(zhì)量濃度為358 ng/μL），將該質(zhì)粒稀釋為6個(gè)濃度梯度（358×10-3、358×10-4、358×10-5、358×10-6、358×10-7、358×10-8ng/μL），以不同濃度的質(zhì)粒為模板進(jìn)行熒光定量PCR，獲得不同濃度對(duì)應(yīng)的Ct值（表2）。以質(zhì)粒濃度為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=-3.374 9x+33.622，其中相關(guān)系數(shù)R2=0.995，且當(dāng)x=0時(shí)，Ct值為33.622，表明該標(biāo)準(zhǔn)曲線較合理，可以滿足后續(xù)試驗(yàn)（圖2）。根據(jù)以下公式計(jì)算不同濃度質(zhì)粒對(duì)應(yīng)的絕對(duì)含量（表2）：

表2 不同稀釋倍數(shù)對(duì)應(yīng)的Ct值

圖2 根據(jù)稀釋倍數(shù)和Ct值制定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 水稻黑條矮縮病株中不同分蘗內(nèi)病毒的絕對(duì)定量

選取RBSDV病株不同分蘗的部分葉部和莖部（標(biāo)記為L(zhǎng)）、根部（標(biāo)記為R）（圖3），根據(jù)熒光定量PCR得到的Ct值，結(jié)合絕對(duì)定量計(jì)算公式和標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，計(jì)算出各病株不同分蘗內(nèi)及根部病毒的絕對(duì)含量（表3）。

圖3 RBSDV水稻病株分蘗數(shù)標(biāo)記及取樣部位

利用單因素方差分析，對(duì)各病株平均病毒含量進(jìn)行兩兩比較發(fā)現(xiàn)，接種RBSDV 40 d后，5棵RBSDV病株的平均病毒含量無(wú)顯著性差異（3.83×105±1.48×105、4.23×105±9.15×104、4.17×105±1.50×105、6.28×105±1.89×105、3.41×105±1.23×105，均在105個(gè)copy/μg RNA），該結(jié)果表明同批次RBSDV的接種效率基本一致，對(duì)后續(xù)開(kāi)展飼毒試驗(yàn)的影響較小。5棵病株不同分蘗內(nèi)的病毒絕對(duì)滴度在104～106個(gè)copy/μgRNA，表明病毒在不同分蘗內(nèi)存在一定的侵染差異，其中一級(jí)分蘗（L3）內(nèi)的病毒含量（1.59×105±2.56×104copy/μgRNA）顯著低于整株病毒含量的平均值（4.38×105±6.39×104copy/μg RNA）（P=0.000 78），該結(jié)果表明病毒更容易在側(cè)分蘗內(nèi)積累，導(dǎo)致分蘗更矮。此外，從表3中可以得出，RBSDV侵染水稻后，利用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，病毒在水稻根部的絕對(duì)含量（7.83×105±1.36×105copy/μgRNA）顯著高于莖葉部的病毒含量（3.71×105±5.39×104copy/μgRNA）（P=0.035）。

表3 水稻黑條矮縮病株不同分蘗內(nèi)病毒的絕對(duì)含量

3 討論與結(jié)論

截至目前，我國(guó)先后報(bào)道了11種水稻病毒病[13]，它們?cè)诓煌瑫r(shí)期對(duì)我國(guó)的糧食生產(chǎn)帶來(lái)了巨大的威脅。其中，有10種病毒由介體飛虱或葉蟬以持久增殖型的方式進(jìn)行傳播，6種來(lái)自于呼腸孤病毒科，2種來(lái)自于彈狀病毒科，2種來(lái)自于白細(xì)病毒科。在這11種水稻病毒中，有8種侵染水稻后出現(xiàn)典型的矮化癥狀。研究表明，病毒侵染后引起植物內(nèi)源激素發(fā)生變化，進(jìn)而促進(jìn)病毒侵染，導(dǎo)致植株矮化，如水稻矮縮病毒（rice dwarf virus，RDV）的結(jié)構(gòu)蛋白P2與赤霉素合成關(guān)鍵蛋白貝殼杉烯氧化酶互作，抑制赤霉素的合成從而導(dǎo)致植物矮縮[14]。部分病毒侵染后引起水稻分蘗增多，如由水稻草矮病毒（rice grassy stunt virus，RGSV）引起的水稻草矮病，病株分蘗急劇增多，呈雜草狀。有研究報(bào)道RGSV侵染后引起的分蘗增多可能與獨(dú)腳金內(nèi)酯（strigolactones，SL）和生長(zhǎng)素（indoleacetic acid，IAA）等激素變化相關(guān)[15-16]，然而目前關(guān)于RGSV分蘗增多的具體的機(jī)制仍不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，與無(wú)毒灰飛虱接種后的水稻相比，RBSDV侵染淮稻5號(hào)40 d后，水稻分蘗數(shù)沒(méi)有明顯增多或減少，推測(cè)RBSDV侵染水稻后未引起SL的變化。

接種RBSDV 40 d后，水稻植株明顯矮縮。通過(guò)計(jì)算發(fā)現(xiàn)，隨機(jī)5棵RBSDV病株內(nèi)病毒含量基本一致，表明同一批次接種RBSDV的效率相對(duì)一致，該結(jié)果對(duì)后續(xù)開(kāi)展水稻黑條矮縮病的抗性鑒定、介體灰飛虱與病毒的互作研究具有一定的指導(dǎo)意義。病株不同分蘗內(nèi)病毒的絕對(duì)滴度存在一定差異，其中一級(jí)分蘗內(nèi)的病毒含量顯著低于整株的病毒含量，病毒在水稻不同分蘗內(nèi)積累的機(jī)制值得深入探究。水稻分蘗的產(chǎn)生過(guò)程包括分蘗芽的形成以及分蘗芽的伸長(zhǎng)[17]，RBSDV如何侵染分蘗芽，以及在何時(shí)侵染新生分蘗組織尚不清楚。水稻分蘗芽頂端分生組織是否具有干細(xì)胞重要調(diào)節(jié)因子WUSCHEL（WUS）[18]，進(jìn)而抑制病毒對(duì)分生組織的侵染，也值得進(jìn)一步深入研究。

筆者研究發(fā)現(xiàn)，RBSDV侵染水稻后，病毒在根部的絕對(duì)含量高于整株的平均病毒含量，推測(cè)RBSDV從莖葉部轉(zhuǎn)移至根部后，更容易在水稻根部復(fù)制和增殖，然而這其中的機(jī)制尚不明確。中國(guó)小麥花葉病毒（Chinese wheat mosaic virus，CWMV）僅可在相對(duì)低溫時(shí)成功侵染煙草，而在24℃卻不能侵染；Andika等研究發(fā)現(xiàn)，沉默煙草根部特異表達(dá)的RNA依賴的RNA聚合酶（NbRDR6）后，僅可以在根部檢測(cè)到CWMV，且NbRDR6可以抑制CWMV的積累以及抑制病毒源小RNA的產(chǎn)生[19]。RBSDV侵染水稻后根部的某些基因是否被誘導(dǎo)，進(jìn)而有利于病毒的侵染，值得進(jìn)一步探究。植物根部通常位于地表下面，負(fù)責(zé)吸收土壤中的水分和無(wú)機(jī)鹽，具有支持、繁殖、貯存合成有機(jī)物的作用，大量病毒在根細(xì)胞內(nèi)積累勢(shì)必會(huì)引起根發(fā)生一系列的生理變化。然而RBSDV如何影響水稻根部正常的生理功能，進(jìn)而影響水稻的生育周期，目前仍不清楚。本研究揭示了RBSDV在水稻不同分蘗及根部的絕對(duì)滴度，可以加深人們對(duì)RBSDV侵染水稻的認(rèn)識(shí)，有望為研究病毒與寄主植物的互作提供一定的理論依據(jù)。