血卟啉單甲醚介導的光動力抗微生物化療法對牙齦卟啉單胞菌體外殺菌效果的研究

欒小敏，路海艷，武笑影，齊 峰，畢良佳

（哈爾濱醫科大學附屬第四醫院口腔科，哈爾濱 150001）

牙周炎是指發生在牙齒支持組織上的慢性感染性疾病，不僅會造成牙槽骨吸收、牙齒松動脫落，影響進食與美觀，還會對我們身體其他的器官造成極大的危害，與心腦血管病、肺炎、胃炎、胃潰瘍等疾病密切相關。孕婦若患重度牙周炎，還會導致早產及低出生體重兒［1-2］。革蘭陰性厭氧菌牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis）被認為是主要的牙周致病菌。許多研究指出，牙齦卟啉單胞菌能夠誘導大量吞噬細胞聚集，在吞噬細菌的同時引發炎癥反應，導致牙周結締組織破壞和牙槽骨吸收，加劇牙周組織破壞的進程［3］。

牙周炎的傳統治療方法是牙周刮治和輔助全身、局部藥物療法。然而牙周刮治器械無法到達較深且形態復雜的牙周袋及病變的根分叉處，菌斑無法完全清除，同時牙周袋深部的細菌沉積和牙周組織中的內毒素會影響治療效果。患者需要反復就診，過程繁瑣復雜，在機械治療的基礎上，如果效果不佳需要使用手術輔助治療，則會增加患者手術創傷及疼痛，引發術后不適，產生心理壓力，導致患者不愿意接受治療［4-5］。臨床上常用全身或局部應用抗生素來輔助治療牙周炎，這種方法雖然可以在一定程度上控制細菌感染，但由于藥物很難在口腔局部微環境中，尤其是牙周袋內長久地維持較高濃度，且細菌不斷繁殖以及DNA變異以抵抗藥物的殺菌作用易造成細菌耐藥性的產生，長期應用，治療效果會逐漸下降，同時藥物還會導致機體出現一些副作用，如惡心、口干、口腔異味、菌群失調等［6］。

因此，臨床上迫切需要找到一種有效的、對患者無傷害或傷害較輕的治療牙周炎的新方法。光動力抗微生物化療法（photodynamic antimierobial chemotherapy，PACT）是利用光敏劑和激光導致微生物病原體光動力滅活的一種抗菌方法，目前尚未發現其耐藥性［7］。卟啉類光敏劑具有良好的光譜特性和較高的單線態氧產率，且在生物體內廣泛存在，代謝途徑明晰，生物相容性好，作為抗菌光敏劑已受到廣泛的研究。血卟啉單甲醚（hematoporphyrin monomethyl ether，HMME）是一種卟啉類光敏劑，體內外試驗表明其有較高的選擇性、較強的光敏性、低毒性，應用于光動力殺菌、腫瘤治療、消炎等方面［8-9］。張蕾等［10］的研究表明40 mg/L HMME介導的光動力療法可有效殺滅大鼠齲病模型中的變形鏈球菌；鄒朝暉等［11］使用HMME聯合80 mW激光可有效殺滅離體牙根管中的糞腸球菌；黃青等［12］發現HMME介導的光動力可有效殺滅牙齦卟啉單胞菌生物膜。HMME用于對口腔牙周致病菌的研究相對較少，因此本試驗研究HMME介導的PACT對牙齦卟啉單胞菌的作用效果，為其臨床應用提供理論基礎與試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

牙齦卟啉單胞菌菌株（ATCC-33277）接種于哥倫比亞血平板，37℃厭氧培養；培養至第二代后，挑取單一菌落用磷酸鹽緩沖液溶液稀釋，調節OD600nm值為1（菌液濃度為108個/mL）備用。光敏劑HMME的配置：HMME（先輝醫藥科技有限公司，上海，中國）粉末固體溶于超純水中，配成1 mg/mL HMME溶液，-20℃冰箱避光保存備用；試驗時用超純水稀釋至所需濃度密封，4℃避光保存備用。腦心浸液培養基購自青島海博生物技術有限公司。L7012 LIVE/DEADTMBacLightTM細菌活力檢測試劑盒購自美國賽默飛世爾科技公司。羥苯基熒光素（hydroxyphenyl-fluorescein，HPF）、單線態氧熒光綠探針（singlet oxygen sensor green，SOSG）購自天津阿爾法生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 檢測HMME光照下產生的活性氧

在黑色96孔酶標板孔中分別加入100 μL 100 μg/mL的HMME，后加入100 μL SOSG/HPF，使其終濃度為10 μmol/L，用移液槍輕吹混勻后分為兩組：無光照組（0 min組）和光照組（10 min組）。無光照組樣本混勻后立即使用熒光分光光度計（SOSG激發波長為504 nm，發射波長為525 nm，HPF激發波長為490 nm，發射波長為515 nm）測量熒光量。光照組使用激光照射10 min后，立即使用熒光分光光度計（SOSG激發波長為504 nm，發射波長為525 nm，HPF激發波長為490 nm，發射波長為515 nm）檢測。

1.2.2 HMME介導的PACT對牙齦卟啉單胞菌的作用

將100 μL牙齦卟啉單胞菌菌懸液加入96孔板中，隨機分為4組，分別為對照組、光照組、HMME組、PACT組。對照組和光照組加入100 μL 無菌磷酸鹽緩沖液，HMME組與PACT組加入光敏劑HMME溶液（使HMME終質量濃度為50 μg/mL），避光孵育90 min，然后使用波長為650 nm的激光（輸出功率為50 mW/cm2）置于96孔板上方垂直照射10 min（光照強度為30 J/cm2）。為了避免激光照射到相鄰的孔，本文采用了黑色不透明的96孔板，樣本間隔操作。各組試驗操作結束后，所有樣本10倍梯度稀釋，取50 μL涂板于哥倫比亞血平板上，恒溫37℃厭氧培養24 h后進行菌落計數，計算細菌存活率。每組3個復孔，重復3次。

1.2.3 激光共聚焦顯微鏡檢測

隨機將細菌樣本分為3組：對照組、HMME組、PACT組，其中HMME組與PACT組加入100 μL HMME溶液（終濃度為50 μg/mL），對照組加入等量無菌磷酸鹽緩沖液作為對照，避光孵育90 min后，PACT組激光光照10 min。各組結束后，移液槍吸樣本于1.5 mL離心管中，離心（10 000×g）15 min，棄上清液，加入0.85%無菌氯化鈉溶液，振蕩混勻，重復操作1次后加入細菌活力檢測試劑盒中避光染色15 min，混勻后移液槍吸5 μL染色菌液于載玻片上，使用激光共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）觀測活/死細菌分布。

1.2.4 HMME與牙齦卟啉單胞菌 zeta電位檢測

為了檢測牙齦卟啉單胞菌帶的負電荷是否影響HMME與其結合，本研究利用Malvern Nano ZS儀器，使用電泳光散射法檢測HMME與牙齦卟啉單胞菌的zeta電位。

1.3 統計學方法

將研究所得數據錄入SPSS 19.0軟件中進行統計學分析，采用單因素方差分析的統計學方法比較不同組別之間的差異。若P＜0.05則差異顯著，有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 檢測HMME光照下產生的活性氧

PACT殺菌機制為光敏劑在光照射下產生活性氧（reactive oxygen species，ROS），進而殺滅細菌，因此用分光光度計檢測HMME產生的ROS。結果顯示，HMME在光照下主要以SOSG熒光量為主，與不光照組相比，結果具有統計學意義（P＜0.05），HPF熒光量差異不顯著（圖1）。

圖1 HMME光激活的ROS試驗Fig.1 ROS experiment on photoactivation of HMME

2.2 HMME介導的PACT對牙齦卟啉單胞菌的作用

如圖2所示，當HMME的濃度為50 μg/mL時，光照10 min后，PACT組細菌存活率最低，74.13%的細菌被殺滅，與對照組相比，差異具有統計學意義（P＜0.05）。單純光敏劑HMME組有少量細菌死亡（P＜0.05）。單純光照對細菌無殺傷作用，與對照組無統計學差異。

圖2 HMME介導PACT對牙齦卟啉單胞菌的殺菌效果Fig.2 The bactericidal effect of PACT mediated by HMME on P.gingivalis

2.3 CLSM檢測

通過CLSM觀察對照組、HMME組、PACT組的牙齦卟啉單胞菌死活菌的分布情況，存活牙齦卟啉單胞菌被染發出綠色熒光，然而細胞膜破壞的滅活細菌被染發紅色熒光，同一視野圖像疊加為橙色。對照組視野下幾乎全顯示綠色熒光，HMME組顯現出少量紅色熒光，說明HMME對牙齦卟啉單胞菌有稍許影響，然而，PACT組顯示幾乎全為紅色熒光，表明HMME-PACT對牙齦卟啉單胞菌處理后，存活細菌大量減少，幾乎都為死菌（green表示活菌，red表示死菌，merge為疊加圖片）。

圖3 CLSM觀測HMME-PACT處理后牙齦卟啉單胞菌變化Fig.3 CLSM observed the change of P.gingivalis after HMMEPACT

2.4 zeta電位

檢測HMME與牙齦卟啉單胞菌的電位，發現兩者均表現出較強的zeta負電位，分別為-11.47 mV和-13.33 mV（圖4）。

圖4 HMME 與 牙齦卟啉單胞菌zeta電位Fig.4 HMME and P.gingivalis zeta potential

3 討論

牙周炎的始動因子是牙菌斑生物膜，其中革蘭厭氧菌牙齦卟啉單胞菌是牙周炎發生發展的主要致病菌［13］。通過表達一系列毒力因子蛋白酶、黏附素、脂多糖等不僅可以直接致病，還可以逃脫宿主免疫反應，間接導致牙周炎變加重［14-15］。傳統治療牙周炎的方法是通過齦下刮治、根面平整輔助使用抗生素治療，但由于創傷大、出血多、根分叉及根面解剖變異處器械難以到達、細菌耐藥等問題導致其治療效果不佳［10］，因此迫切需要一種新型的牙周炎治療方法。

PACT是光激發光敏劑產生的細胞毒作用，光敏劑是影響PACT療效的重要的元素。HMME是一種新型二代光敏劑［16-17］，相比于其他光敏劑，其具有結構穩定、對正常組織低毒性、避光期相對較短、ROS產量高等優點，而且與血卟啉衍生物相比價格便宜（第一代光敏劑）［15］，因此，已被廣泛用于治療腫瘤、感染等各種疾病的研究［18］，是一種用于PACT的非常有前景的光敏劑。

PACT通過激活光敏劑產生ROS殺菌［13］。ROS產生種類很多［19-20］，本試驗使用的是ROS熒光分子探針SOSG和HPF，SOSG用于檢測單線態氧，HPF用于檢測羥基自由基。結果顯示，HMME在10 min光照后以SOSG熒光為主（P＜0.05），而光動力殺菌機制中Ⅱ型反應主要產生單線態氧，說明HMMEPACT主要通過Ⅱ型反應來達到殺菌的目的。

試驗所選用的HMME濃度是課題組成員篩選的較為理想的濃度，此濃度光敏劑的毒性作用較低，并且在此濃度下對正常細胞不會造成損害。如圖2所示，當HMME的質量濃度為50 μg/mL時，光照10 min后可以有效殺滅牙齦卟啉單胞菌，滅菌率達到74.13%（P＜0.05）。HMME介導的PACT的作用機制可能為：當結合在牙齦卟啉單胞菌上的HMME受到特定波長激光激活后，主要通過能量轉移（Ⅱ型）機制產生大量的單線態氧，破壞牙齦卟啉單胞菌的基本組成，導致牙齦卟啉單胞菌死亡［21］。但其并沒有完全殺滅牙齦卟啉單胞菌，可能是因為革蘭陰性厭氧菌牙齦卟啉單胞菌表面帶負電荷，同時HMME表面的zeta電位也為負電荷（圖4），兩者均為負電荷會影響牙齦卟啉單胞菌與HMME相互結合，進而影響PACT的殺菌效果。另外革蘭陰性菌細胞壁外由脂蛋白、脂質雙層和脂多糖構成外膜，具有屏障作用，能阻止光敏劑進入，所以，牙齦卟啉單胞菌對光敏劑的結合量較少，從而影響殺菌效果。后期將繼續深入研究對光敏劑改性，提高其與革蘭陰性菌的結合能力，同時提高試驗參數，以達到最佳的PACT殺菌效果。單純光敏劑HMME組有少量細菌死亡（P＜0.05），表明HMME對牙齦卟啉單胞菌有輕微毒性作用，而光照組細菌存活率無變化，表明650 nm激光對牙齦卟啉單胞菌無殺傷作用。CLSM觀察結果一致，HMME介導的PACT組視野內幾乎全部為紅色熒光，剩余較少綠色熒光，表明HMME介導的PACT可有效殺滅細菌。

針對牙周炎各種療法的弊端，PACT顯示出其獨特優勢，具有無創、細菌不耐受、簡便易行、價格低廉、患者易于接受等優點［22］。本試驗HMME介導的PACT有望為治療牙周炎提供理論指導及試驗依據。然而，牙周炎是菌斑生物膜引起的炎癥性病變，需要更多關于HMME介導的PACT對以牙齦卟啉單胞菌為主的菌斑生物膜殺菌效果的研究，并且相關的動物試驗也值得我們進一步探討與論證。相信HMME介導的PACT不僅能提高牙周炎患者的治療效果，同時也能減輕治療的痛苦，有希望成為輔助治療牙周炎的有效方法。