肝癌條件培養基對血管內皮細胞形貌和超微結構的影響

巫 青，楊尚霖，陳俊鵬，謝學羿，溫順前

（佛山市第二人民醫院肝膽外科，佛山 528000）

惡性腫瘤通過血管吸收營養和氧氣以支持腫瘤快速生長，同時也利用血管進行擴散轉移，其轉移關鍵取決于腫瘤細胞穿透內皮層進入和移出脈管系統的速度，即內滲和外滲［1］。腫瘤細胞與內皮細胞是腫瘤微環境的主要細胞，其相互作用貫穿于腫瘤發生發展的整個過程［2］。盡管有證據表明腫瘤細胞可以通過細胞間的相互作用和旁分泌效應，以及釋放多種可以增強腫瘤侵襲性的生長因子、趨化因子和基質降解酶，來與局部微環境相互作用［3］，但是在這個過程中腫瘤細胞將誘導內皮細胞出現什么樣的變化并不清楚。因此，研究這個過程中內皮細胞的形態和功能是非常重要的。本試驗將人肝癌細胞條件培養基（HepG2 conditioned medium，HepG2-CM）與人臍靜脈血管內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）共培養，模擬腫瘤微環境，觀察HepG2-CM對HUVEC細胞形貌和超微結構的變化。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

人肝癌細胞株HepG2和HUVEC細胞為本實驗室凍存，胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibco公司，M199培養液、L-谷氨酰胺、青鏈霉素購自美國Hyclone公司，培養板、培養瓶購自美國Corning公司。倒置顯微鏡購自日本Olympus公司，原子力顯微鏡（atomic force microscopy，AFM）購自美國Thermo microscope公司，掃描電鏡（scanning electron microscopy，SEM）購自日本日立高新技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HUVEC細胞培養

用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素的M199培養液，在含5% CO2、37℃的培養箱中對HUVEC細胞進行培養。

1.2.2 HepG2-CM的制備

參考Pan等［4］的方法，收集處于對數生長期的HepG2細胞，調節細胞濃度至2×106個/mL，用含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 mg/mL的M199培養液于37℃、5% CO2培養箱中培養48 h后，棄去原培養基，用PBS緩沖液清洗3遍后加入無血清培養基過夜饑餓處理，次日收集HepG2細胞培養上清液，2 000 r/min離心5 min，經直徑為0.22 μm的微孔濾膜過濾，以除去漂浮的腫瘤細胞，配成50%的體積比備用。

1.2.3 HepG2-CM誘導HUVEC細胞的形態學觀察

取對數生長期的HUVEC細胞，調整細胞濃度至2×105個/mL接種于6孔培養板，每孔2 mL，貼壁生長12 h后加入2 mL HepG2-CM，對照組只加無血清培養液。將其分別作用HUVEC細胞24 h，用倒置顯微鏡觀察各組細胞的生長狀況和形態變化，并拍照記錄。

1.2.4 SEM觀察HUVEC細胞的形貌

在6孔板內放入22 mm×22 mm的無菌云母玻片，每孔加入1×104個/mL的HUVEC細胞懸液2 mL，使細胞均勻爬片。貼壁生長12 h后，試驗組加入2 mL HepG2-CM，對照組只加無血清培養液，繼續培養24 h。將玻片從培養孔取出，用PBS緩沖液于搖床上輕輕洗3遍，每遍5 min，然后用2.5%的戊二醛浸沒玻片，置于4℃冰箱固定過夜，超純水清洗細胞3次，每次5 min，以除去固定液；使用30%、50%、70%、90%、100%的梯度乙醇脫水，每級梯度處理10 min；樣品經由無水乙醇與醋酸異戊酯（體積比為1∶1）的混合液過渡，并轉入純醋酸異戊酯以置換酒精，每次約10 min；按“進氣-浸泡-置換（3次）-升溫-放氣”等步驟進行CO2臨界點干燥；將干燥后的樣品轉移到銅臺上，置于離子濺射儀中，抽真空20 min，噴金10 min。

1.2.5 AFM觀察HUVEC細胞的超微結構

在6孔板內放入22 mm×22 mm的無菌云母玻片，每孔加入1×104個/mL的HUVEC細胞懸液2 mL。細胞均勻爬片后，試驗組加入2 mL HepG2-CM，對照組只加無血清培養液，繼續培養24 h后將玻片取出，用PBS于搖床上輕輕洗3遍，然后用4%的多聚甲醛固定15 min，蒸餾水輕輕沖洗3次，室溫自然干燥后立即進行AFM掃描。將載有細胞樣品的玻片固定在AFM的掃描臺上，用監視器定位待掃描的樣品區域，對樣品進行掃描成像。采用100 μm掃描器和UL2.0B硅探針，力常數為2.8 N/m，在空氣中室溫下進行掃描，以接觸模式成像。所有圖像僅經儀器配置軟件（IP 2.1）平滑處理，以消除掃描方向上的低頻背景噪音。

1.3 統計學分析

2 結果與分析

2.1 倒置顯微鏡觀察HUVEC細胞形態

在倒置顯微鏡下觀察各組HUVEC細胞形態的變化（圖1）。正常情況下，HUVEC細胞呈梭形致密排列，細胞間緊密連接，鑲嵌形成“鋪路石”樣結構；HepG2-CM誘導的HUVEC細胞伸長，呈長梭形，黏附減弱，細胞間隙更疏松。

圖1 倒置顯微鏡觀察HUVEC細胞形態（200×）Fig.1 The morphology of HUVEC cells was observed by inverted microscope (200×)

2.2 SEM觀察各組HUVEC細胞形貌

利用高分辨率SEM對HUVEC細胞成像，觀察細胞形貌的變化，結果如圖2所示：對照組HUVEC細胞呈梭形，細胞膜表面有顆粒樣物質；HepG2-CM刺激后HUVEC細胞伸長，細胞膜向四方伸展，細胞表面有很多顆粒樣物質突起，“偽足”樣突起明顯增多。

圖2 SEM觀察HUVEC細胞形貌（5 000×）Fig.2 The morphology of HUVEC cells was observed by SEM (5 000×)

2.3 AFM觀察HUVEC細胞形貌

通過AFM觀察各組HUVEC細胞形貌圖和對應的拓補圖可發現（圖3），對照組HUVEC細胞呈梭形，細胞核突出，細胞飽滿，邊緣相對平整，無明顯細胞膜延伸，相鄰細胞之間緊密依靠，細胞黏附排列致密，這是無HepG2-CM刺激狀態下HUVEC細胞的形貌特征。由于HepG2-CM的刺激，細胞運動活躍，HUVEC細胞伸長，呈長梭形，細胞核塌陷，黏附減弱，細胞膜向四方伸展，邊緣模糊，與相鄰細胞之間連接疏散，邊緣可見明顯“偽足”樣突起（圖3b黑色箭頭）。

圖3 AFM觀察HUVEC細胞形貌Fig.3 The morphology of HUVEC cells was observed by AFM

2.4 細胞超微結構分析

圖4為各組細胞的超微結構圖和細胞膜表面粒徑分布圖。結果顯示，對照組細胞邊緣相對平整，表面顆粒較小（圖4a），HepG2-CM作用后細胞邊緣不平整，出現“偽足”樣突起（圖4b箭頭所示），表面顆粒變大，粒徑分布明顯右移（圖4c、4d）。

圖4 各組HUVEC細胞的超微結構圖和細胞膜表面粒徑分布圖Fig.4 Ultrastructural and particle size distribution of cell membrane surface of HUVEC in each group

2.5 細胞膜表面粗糙度分析

用AFM自帶軟件對上述細胞膜表面超微結構進行測量，得到超微結構幾何參數值的不同數值：高低差（peak to valley roughness，Rp-v）、均方根粗糙度（root-mean-square roughness，Rq）、平均粗糙度（Average roughness，Ra）、平均高度（Meant Ht）、中位數高度（Median Ht）均反應細胞膜表面粗糙度的變化。分別測量每組4個細胞的不同區域，對這些數值進行統計分析，結果顯示（圖5），HepG2-CM處理前后幾何參數均發生明顯變化，Rp-v分別為（454.83±29.99）nm和（501.28±11.78）nm，P=0.028；Rq分別為（32.84±4.70）nm和（45.03±3.84）nm，P=0.007；Ra分別為（25.06±4.09）nm和（34.39±3.58）nm，P=0.014；Meant Ht分別為（204.03±11.65）nm和（301.48±12.80）nm，P=0；Median Ht分別為（206.55±7.46）nm和（313.25±5.89）nm，P=0。結果表明，HepG2-CM處理后細胞表面粗糙度明顯增加。

圖5 各組HUVEC細胞膜表面粗糙度的分析Fig.5 Analysis of surface roughness of HUVEC cell membrane in each group

3 討論

轉移是癌癥患者死亡的首要原因，其過程包括原位浸潤、腫瘤細胞內滲、循環系統存活、腫瘤細胞外滲、轉移灶形成等［5］。移行的腫瘤細胞通過內滲進入血管內離開原發腫瘤，通過循環擴散到全身，最后定植到提供適當微環境的遠處器官中［6］。其中，腫瘤細胞穿透內皮層進入和移出脈管系統，即內滲和外滲是重要步驟［1］。在這個過程中必然引起內皮細胞形態和超微結構的變化，許多研究焦點都集中于腫瘤細胞如何穿透內皮層，而未觀察內皮細胞形態的變化。因此，研究腫瘤細胞誘導下血管內皮細胞形貌和超微結構的變化具有很重要的意義。

腫瘤細胞與內皮細胞在腫瘤微環境中的相互作用始終貫穿于腫瘤發生發展的全過程，內皮細胞可以向腫瘤細胞提供一些信號來促進腫瘤細胞的轉移［7］，腫瘤細胞也可以通過多種方式誘導內皮細胞通透性增加。一方面，來自腫瘤細胞的外泌體通過觸發內皮細胞中的內質網應激和減少緊密連接相關蛋白破壞血管完整性，從而促進腫瘤轉移的發生［6］。Lin等［6］不僅在體外試驗中用外泌體處理單層內皮細胞，使其通透性增加，而且在體內試驗中將其注射到小鼠體內，也增加了血管通透性和腫瘤轉移。另一方面，腫瘤細胞條件培養基中富含促血管內皮生長因子，能誘導內皮細胞的遷移［8-10］。Jean等［11］將釋放血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的腫瘤細胞與體外培養的內皮細胞一起培養，發現這些腫瘤細胞先黏附到內皮細胞層，然后再從中穿過。我們之前的研究也顯示，HepG2-CM內豐富的VEGF能誘導HUVEC細胞遷移，且引起細胞骨架重排［4］。VEGF又稱血管通透因子（vascular permeability factor，VPF），是目前發現特異性最高、促血管作用最強的促血管生成可溶性因子。它通過直接與內皮細胞上相應受體（如Flt-1和VEGFR-2）高親和力結合，啟動其下游的信號轉導，進而激活內皮細胞，不僅可以誘導內皮細胞增殖、遷移和管腔形成，還可以增加血管通透性［12］。

為了更好地模擬體內腫瘤組織復雜的微環境，試驗采用間接共培養的方法構建了HepG2-CM和HUVEC細胞的體外共培養模型，通過高分辨率的SEM及AFM初步觀察了HepG2-CM誘導HUVEC細胞形貌及超微結構的變化，并對其細胞膜表面粗糙度進行分析。結果表明，HepG2-CM誘導HUVEC細胞膜向四方伸展，出現明顯“偽足”樣突起，細胞膜表面粗糙度增加，減弱了細胞的黏附及細胞之間的緊密連接效果。這些是內皮細胞運動活躍的表現，表明HepG2-CM刺激了HUVEC細胞的活性［13］。研究表明，細胞間緊密連接蛋白與胃腸道腫瘤和肝臟疾病密切相關［14］，尤其是腫瘤細胞的侵襲和轉移，緊密連接蛋白的下調或丟失會改變細胞遷移、增殖、極性和分化，從而促進癌癥的進展［15］。血管內皮細胞間的連接結構有緊密連接、黏附連接、縫隙連接等，其中緊密連接在血管完整性中起重要作用，并控制單層內皮的通透性［6］。高劑量貝伐單抗通過TGF-β1信號通路降低緊密連接蛋白CLDN5的表達，從而增強內皮細胞的遷移、侵襲和滲漏能力［16］，而納米金通過上調內皮細胞上的VE-鈣黏蛋白水平來加強緊密連接，降低血管通透性［17］。Escribano等［1］通過建立內皮細胞單層計算模型來研究內皮細胞間隙形成的機制，結果顯示，機械力的平衡驅動內皮間隙的形成，從而導致癌細胞的外滲。他認為，力學作用讓細胞結構發生變化，細胞會被這樣的力量沿著不同的方向拉扯推動，最終導致細胞之間發生裂痕，出現了暫時的空隙，且隨著內皮細胞連接變得穩定，縫隙打開的頻率會降低。

綜上所述，HUVEC出現上述形貌和超微結構的變化可能是這個過程中HepG2-CM誘導細胞遷移引起力學的變化導致細胞之間出現了暫時的空隙，破壞了內皮細胞的緊密連接，增加了血管通透性。腫瘤轉移時腫瘤細胞如何穿越內皮細胞屏障是關鍵，也是防治腫瘤轉移的靶點［18］。因此，對內皮細胞形貌和超微結構的研究將有助于我們進一步理解腫瘤微環境中血管內皮細胞的生物學行為，為抗腫瘤血管生成的研究提供思路。