防己黃芪湯治療小兒腎病綜合征的網絡藥理學機制分析

胡紅蕾，于心田，孫冬冬，刁娟娟

（1.山東中醫藥大學，濟南 250014；2.山東中醫藥大學第一附屬醫院，濟南 250014）

小兒腎病綜合征（nephrotic syndrome，NS）是一組因腎小球濾過功能失常而出現的以大量蛋白尿、低蛋白血癥、高脂血癥及水腫為主要特點的臨床綜合征［1］，以2～8歲的兒童常見，西方醫學的發病機制尚不完全明確。大量研究發現其可能與免疫失調相關［2-6］。目前一線治療藥物為糖皮質激素，但是會出現生長抑制、代謝紊亂、感染加重等多種副作用，常見激素依賴和激素耐藥的現象。尤其對于難治性腎病，往往需要二線免疫抑制劑治療，但不同患兒治療效果差異大，同時又伴有嚴重的副作用，給患兒及家長帶來了極大的困擾。

防己黃芪湯出自《金匱要略·痙濕暍病脈證并治》。“風濕，脈浮身重，汗出惡風者，防己黃芪湯主之”為益氣祛風利水的經典方劑。現代大量研究表明，此經方在調節免疫功能、減少尿蛋白和改善腎功能方面有不錯的效果［7-10］，但其治療小兒NS的作用機制缺乏具體研究。中醫網絡藥理學方法利用新的“網絡靶點多組分”模式，從系統的角度和分子水平詮釋中醫，并以高通量方式分析配方，同時解釋了草藥配方的組合規則和網絡調節作用［11］。本文基于中醫網絡藥理學對防己黃芪湯中的藥物、疾病靶點、富集通路、生物過程進行系統和分子層面的研究，并通過分子對接對關鍵靶蛋白與藥物小分子的結合效果進行驗證，以期為進一步的機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 篩選藥物有效成分及靶點

先在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中依次輸入 “防己”“黃芪”“甘草”“白術”等檢索成分，同時挖掘現有文獻補充未挖掘到的成分，后對所得成分去重整理，并在TCMSP平臺上進行靶點預測，再通過Uniprot數據庫（https://www.uniprot.org/）規范靶點。

1.2 預測疾病潛在靶點

分別在OMIM（https://omim.org）、DisGenet（https://www.disgenet.org）數據庫中輸入“Nephrotic syndrome in children”“Pediatric nephrotic syndrome”以獲取小兒NS靶點，并查閱文獻補充靶點，對靶點進行去重整理后，通過Uniprot數據庫規范靶點。

1.3 繪制韋恩圖獲取交集靶點

把規范后的藥物和疾病靶點導入韋恩在線平臺（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）繪制韋恩圖，其共有靶點即為防己黃芪湯治療小兒NS的潛在靶點。

1.4 繪制交集靶點-成分-藥物網絡圖

先構建共有靶點-防己黃芪湯成分-藥物關系表，導入Cytoscape3.7.2軟件繪制靶點-成分-藥物網絡圖，再通過Network Analyzer工具進行自由度拓撲分析，最后依據自由度選取關鍵成分。

1.5 構建蛋白互相作用關系（PPI）網絡圖

先把共有靶點導入String11.0線上平臺（https://www.string-db.org），“Organism”設置為“Homo sapiens”，置信度設置為 0.4，以獲取蛋白互相作用關系（protein-protein interactions，PPI）網絡圖；再下載PPI tsv文件，并導入Cytoscape3.7.2軟件進行拓撲分析以選取關鍵靶點，最后通過Mcode Cluster插件進行網絡模塊降維分解。

1.6 京都基因與基因組百科全書（KEGG）、基因本體論（GO）富集分析

Metascape是一個功能強大的基因功能注釋分析工具，能幫助用戶實現對基因或蛋白功能的認知［12］。先把共有靶點導入Metascape平臺進行基因本體論（gene oncology，GO）的生物過程（biological processes）及京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集通路分析，再通過R語言實現結果可視化。

1.7 分子對接

對關鍵靶點和關鍵成分進行分子對接驗證。先在Pemchem數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載蛋白配體，通過Chem3D、AUTODOCK轉化為pdbqt形式；后在PDB平臺（https://www1.rcsb.org/）上下載蛋白受體，通過pymol去除溶劑和有機物，去水、加氫、加電荷、計算電荷處理后保存為pdbqt形式；再結合文獻確定活性口袋坐標，通過命令提示符輸入對接命令對配體和受體蛋白進行對接驗證；最后通過OpenBal、pymol處理對接后的蛋白結構以實現可視化。

2 結果與分析

2.1 防己黃芪湯成分的相關靶點

依據口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥ 30%、類藥性（drug likeness，DL）≥ 0.18在TCMSP數據庫檢索到“防己”成分3個（靶點36個）、“黃芪”成分20個（靶點197個）、“白術”成分7個（靶點18個）。依據ADME 參數［脂水分配系數（AlogP）＜ 5、H 鍵供體數量（Hdon）＜ 5、H 鍵受體數量（Hacc）＜ 5、腸上皮通透性（Caco-2）≥ -0.40［13］］檢索到“甘草”化學成分為62個（靶點109個）。對四味藥物所對應的成分靶點進行整理去重后，共獲得78個有效成分（206個靶點）。

2.2 小兒腎病綜合征的相關靶點

通過OMIM、OMIM Gene Map、Disgenet數據平臺檢索到疾病靶點分別為89、859、1 538個，整理去除734個重復值，并補充文獻挖掘所獲取的2個靶點，最終共獲得1 754個疾病靶點。

2.3 韋恩圖和復方疾病的共有靶點

把206個藥物靶點和1 754個疾病靶點導入韋恩在線平臺，獲得48個交集靶點，即為防己黃芪湯治療小兒NS的潛在生物靶點（圖1）。

圖1 防己黃芪湯-疾病共有靶點韋恩圖Fig.1 Vnne diagram of Fangji Huangqi Decoction disease common targets.

2.4 交集靶點-成分-藥物網絡圖

把共有靶點、藥物、作用于共有靶點的活性成分導入Cytoscape3.7.2軟件繪成分-共有靶點-藥物網絡圖，并通過Network Analyzer進行拓撲分析（圖2）。圖中包含48個共有靶點、68個藥效成分（表1）、4味中藥、 120個節點、491條邊。選取圖中自由度前五的活性成分為關鍵成分，其中活性成分中自由度最高的是槲皮素（quercetin），作用于34個疾病靶點，其次為7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇（7-O-methylisomucronulatol）、4′，-甲氧基光甘草定（2-［(3R)-8，8-dimethyl-3，4-dihydro-2H-pyrano［6，5-f］chromen-3-yl］-5-methoxyphenol）、山奈酚（kaempferol）和美迪紫檀（medicarpin）。

表1 （續表）Tab.1 (continued)

表1 （續表）Tab.1 (continued)

表1 藥物活性成分Tab.1 Pharmaceutical active ingredients

圖2 防己黃芪湯活性成分-疾病藥物共同靶點網絡Fig.2 Network of target proteins of the active ingredient of Fangji Huangqi Decoction-drug disease

2.5 PPI網絡圖和子模塊網絡圖

首先把共有靶點導入String平臺，以獲取PPI網絡圖（圖3），圖中有48個節點，261條邊，平均節點度為10.9。然后以tsv格式下載并導入Sytoscape軟件進行拓撲分析（圖4a），舍棄3個游離靶點后，圖中共45個節點，261條邊。圖4a中紫色圖標為Degree值大于17的11個靶蛋白（表2），提示可能是防己黃芪湯治療小兒NS的重要作用靶點。同時選取自由度前3的TP53、MYC、AKT1為關鍵靶蛋白。最后通過Cluster Maker插件的Mcode Cluster功能對其進行聚類分析，得到3個關系緊密的子功能模塊（圖4b）。Mcode 1（17節點模塊）主要與癌癥通路相關，Mcode 2（7節點模塊）主要與PI3K-Akt信號通路相關，Mcode 3（3節點模塊）主要與丙型肝炎相關。

圖3 PPI網絡圖Fig.3 PPI network diagram

表2 蛋白互作網絡重要靶點Tab.2 Important targets of protein interaction network

圖4 PPI拓撲分析網絡圖及子模塊網絡圖Fig.4 Protein interaction diagram and sub module

2.6 KEGG和GO富集通路

先把共有靶點導入Metascape平臺進行KEGG通路富集分析，選取P值前20的通路，再通過R語言繪制氣泡圖（圖5），圖中氣泡大小表示富集靶點數量，顏色表示P值大小，然后根據每條通路富集靶點數繪制條形圖（圖6）。結果表明，防己黃芪湯對小兒NS的治療作用與癌癥相關通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、丙型肝炎、乙型肝炎、卡波西氏肉瘤相關皰疹病毒感染、人巨細胞病毒感染等通路有關。通過Metascape平臺對GO生物過程進行富集聚類分析（圖7），圖中節點表示通路，節點大小表示通路富集靶點的數量（靶點越多節點越大），邊表示節點間的共同基因，邊的寬度表示共同基因的數量（邊越寬表示共同基因越多）。圖7a中節點顏色依據P值大小變化而變化，圖7b中節點的顏色依據不同的生物過程變化而變化。圖8為繪制的聚類條形圖，其分析結果主要涉及循環系統、細胞對氮化合物的反應、上皮細胞增殖、對機械刺激的反應、生長調節、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調節、細胞分化、對無機物的反應、細胞對有機環狀化合物的反應、肽基酪氨酸磷酸化體液水平的調節、腺體發育、心臟發育等多種復雜的生物過程。

圖5 KEGG富集氣泡圖Fig.5 KEGG enrichment bubble diagram

圖6 KEGG富集條形圖Fig.6 KEGG enrichment bar chart

圖7 GO富集聚類圖Fig.7 GO enrichment cluster diagram

圖8 GO聚類條形圖Fig.8 Go clustering bar graph

2.7 分子對接

關鍵蛋白和關鍵成分的對接結果均小于-5.0 kcal/mol （圖9），且AKT1與槲皮素、山奈酚、美迪紫檀素、4′，-甲氧基光甘草定的對接結果均小于-8.0 kcal/mol（圖10、11）。結合能數值越小，表明對接效果越好，小分子化合物與大分子蛋白對接結構越穩定，越有可能發生相互作用。此結果驗證了防己黃芪湯中槲皮素、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇、山奈酚、美迪紫檀素、4′，-甲氧基光甘草定有效作用于靶點AKT1、TP53、MYC的可能性。

圖9 對接結構結合能熱圖Fig.9 Heat map of binding energy of docking structure

圖10 分子對接結果模式圖Fig.10 Molecular docking result pattern

3 討論

腎病綜合征在古籍中并沒有完全對應的病名，但依據臨床癥狀可歸為“尿濁”“水腫”的范疇。《景岳全書·腫脹》中說：“凡水腫等癥，乃肺脾腎三臟相干之病，蓋水為至陰，故其本在腎；水化于氣，故其標在肺；水唯畏土，故其制在脾。今肺虛則氣不化精而化水，脾虛則土不制水而反克，腎虛則水無主而妄行”。 故本病病機主要與肺脾腎三臟失司相關，臨床早期多以肺脾氣虛，脾腎陽虛為主，遷延日久陽損及陰又可引起氣陰兩虛或肝腎陰虛。防己黃芪湯聯合西醫治療不僅能有效改善腎病綜合征患兒的免疫紊亂［14］，對患者 24 h 蛋白尿、肌酐、尿素氮和尿酸水平的調節具有顯著優勢，且不會增加不良反應［15］。

本研究共挖掘到防己黃芪湯相關靶點206個，疾病相關靶點1 754個，疾病復方共有靶點48個，防己黃芪湯中有68個活性成分作用于共同靶點。其中關鍵活性成分有槲皮素、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇、山奈酚、美迪紫檀素、4′，-甲氧基光甘草定，關鍵靶點為AKT1、MYC、TP53。結合目前研究發現，KEGG富集通路主要涉及MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路，GO富集分析結果主要涉及循環系統、細胞應激、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調節及細胞分化等生物過程。

圖11 蛋白結合位點結構圖Fig.11 Protein binding site structure

關于活性成分，槲皮素是植物界分布廣泛，具有多種生物活性的黃酮醇類化合物，可抑制腎間質中CD68+巨噬細胞的浸潤，并下調 NF-κB p65和IRF5 的活性，使上游信號TLR4/Myd88失活，拮抗TGF-β1/Smad2/3信號的傳導，從而抑制F4/80+/CD11b+/CD206+M2巨噬細胞的極化，以減少細胞外基質的過度積累和間質纖維化［16］。山奈酚具有抗癌、抗炎、抗病毒、防治糖尿病等多種生物活性，可顯著抑制脂多糖誘導的急性腎損傷過程中炎癥因子、炎癥通路蛋白的升高，對急性腎功能損傷具有顯著的保護作用［17］。美迪紫檀是二氫異黃酮的第二大類群，被認為是一類重要的植物抗毒素，具有抗菌、抗炎、抗氧化劑、免疫抑制活性抑制的作用［18-22］，而小兒NS與炎癥反應、免疫紊亂密切相關，推測美迪紫檀素可通過調節炎癥反應和免疫狀況調控小兒NS。7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇、4′，-甲氧基光甘草定雖作用于小兒NS的潛在靶點數量多，分子對接驗證了其蛋白對接結構穩定，結合能力好，但目前仍缺乏相關研究，具體作用機制仍待挖掘。

關于關鍵靶點，AKT1 缺失會增加腎臟缺血再灌注期間的腎小管凋亡和炎癥反應，從而加劇腎臟損傷［23］，而增強腎小管AKT1信號可減少再灌注后的腎損傷，提高存活率［24］。MYC為腎損傷過程中的關鍵靶蛋白，在腎臟特異性敲除小鼠中Cxcl12和MYC基因缺失會抑制線粒體代謝和糖酵解，并延遲缺血/再灌注損傷后的恢復［25］。AFB1 可通過PLK1、PLD1 和 MYC 上調 p21 的表達，誘導腎損傷［26］；TP53 是一種眾所周知的腫瘤抑制因子，通過調節各種細胞生物學過程，包括細胞凋亡、細胞周期停滯和自噬，在急性腎損傷和隨后的腎臟修復中發揮關鍵作用［27］。 慢性腎臟疾病與腎組織中的轉化生長因子-β、p53、缺氧誘導因子的變化及主要發育途徑的激活密切相關［28］。

關于富集通路， MAPK是一組能被不同的細胞外刺激（如細胞因子、神經遞質、激素、細胞應激及細胞黏附等）激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶， 根據序列相似性、上游激活因子和次級特異性，可分ERKs、JNK、p38三大類。ERKs主要與生長因子相關信號相關，JNK和p38家族主要與細胞的應激和炎癥反應相關。研究發現，p38、ERK1/2 和 JNK磷酸化后可有效減少急性腎損傷腎臟中凋亡細胞的數量［29］。激活p38 MAPK 信號通路能有效調控炎癥反應，從而減輕腎切除大鼠的腎損傷［30］，同時MAPK的低表達可影響腎纖維化的進展［31］。PI3K蛋白家族參與細胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉運等多種細胞功能的調節。相關研究表明：激活PI3K/Akt 信號通路可減輕缺血再灌注腎損傷［32］；敲低PI3K的短發夾 RNAk可降低對纖維化的抑制［33］；減少PI3K信號傳導可異位激活 β-連環蛋白途徑，觸發祖細胞的過早分化；PI3K信號通路聯合其他通路可微調腎單位祖細胞自我更新和分化之間的平衡［34］。相關研究進一步證實了MAPK和PI3K-Akt信號通路在小兒防己黃芪湯通過復雜的生物過程多途徑調控腎臟疾病中的重要作用。

綜上，防己黃芪湯對于小兒NS的治療主要依賴于MAPK和PI3K-Akt兩條信號通路，并且通過槲皮素、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇、山奈酚、美迪紫檀素、4′，-甲氧基光甘草定等活性成分作用于MYC、AKT1靶蛋白，同時需要循環系統、細胞應激、生長調節、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調節、白細胞分化等多種生物過程的參與來實現多成分、多靶點、多層次、多途徑復雜的綜合調控。本文揭示了防己黃芪湯治療小兒NS的機制，并為臨床進一步研究和應用提供了新的參考，但網絡藥理學方法仍有一定的局限性。首先，現有的數據庫是不完整的，此研究數據中黃芪甘草的成分靶點信息量大，而防己、白術信息量少，可能會導致核心靶點關鍵成分篩選出現偏差；其次，網絡藥理學在中藥方劑研究中的應用主要處于定性階段，而無法涉及藥物與疾病之間的量效關系，如在中醫學中復方藥物劑量的增減會改變藥物的作用，那么藥物劑量變化是否可影響關鍵成分和關鍵靶點的篩選，是否會導致生物過程的變化尚未可知。未來，隨著網絡藥理學技術的普及和儀器分析、數據分析的發展，期待可以找到一種超高通量、快速、無損的方法來有效地解決上述局限性［35］。