基于NOS 通路探討DAHP 對腦外傷大鼠的神經保護作用

倪禮禮,姚 佳,汪學猛,杜 煜

(1.洛陽職業技術學院食品與藥品學院,河南 洛陽 471900;2.信陽職業技術學院藥學院,河南 信陽 464000)

腦外傷屬于臨床常見顱腦損傷類型之一,通常會造成患者行為、精神、記憶學習等方面功能障礙,具有較高的致死率和致殘率,嚴重影響患者生活質量[1]。 腦外傷機制較復雜,主要涉及神經損傷、腦水腫、血腦屏障等,目前尚未有統一定論。 一氧化氮(nitric oxide,NO)屬于神經介質,正常狀態下少量NO 可調節血流、擴張血管,而過量的NO 則會對神經細胞產生毒性[2]。 研究發現腦損傷后可激活一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)生成大量的NO,進而加重神經損傷[3]。 2,4-二胺-6-羥基嘧啶(2,4-diamino-6-hydroxypyrimidine,DAHP)為三磷酸鳥苷環化水解酶 1 ( guanosine triphosphate cyclohydrolase 1,GCH1)抑制劑,可通過抑制GCH1的合成進而降低誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的表達,影響NO 的合成,然而其在腦損傷中的作用研究不多[4]。 本研究通過復制腦外傷模型大鼠,并給予DAHP 干預,旨在探究其對腦外傷大鼠的神經保護作用及可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

70 只SPF 級SD 健康大鼠,雄性,8 周齡,體重(200±20)g,由河南環宇康禾生物科技有限公司提供[SCXK(豫)2020-0004],動物飼養在洛陽職業技術學院食品與藥品學院實驗室[SYXK(豫)2020-0027],濕度(40±10)%,溫度(22±3)℃,采用晝夜交替12 h 光照,期間大鼠自由飲食、飲水,一周后用于造模,實驗遵循3R 原則。 本研究經洛陽職業技術學院倫理委員會批準(LDS2020024)。

1.2 主要試劑與儀器

DAHP(購自美國Cayman 公司,批號:81260-1);四氫生物蝶呤(tetrahydrobiopterin,BH4)(購自美國MCE 公司,批號:HY-107383);蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(購自碧云天生物技術有限公司,批號:C0105);Tunel 細胞凋亡檢測試劑盒(購自美國ROCHE 公司,批號:11684817910);NO 檢測試劑盒(購自美國Solarbio 公司,批號:BC147);BCA 蛋白檢測試劑盒(購自美國Thermo Scientific 公司,批號:23225);兔抗鼠神經型一氧化氮合酶(nNOS)、iNOS、β-肌動蛋白(β-actin)一抗(購自美國Sigma公司,批號:SAB4502010、SAB4502012、A5441);兔抗鼠核因子-κB(NF-κB)、腫瘤壞死因子-α(TNFα)、環氧化酶-2(COX-2)一抗(購自美國R&D 公司,批號:MAB5078、AF-425-PB、AF4198);兔抗鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、B 淋巴細胞瘤-2 基因(Bcl-2)一抗、辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗(購自英國Abcam 公司,批號:ab179517、ab185002、ab10032);光學顯微鏡(購自日本奧林巴斯公司,型號:IX51);熒光顯微鏡(購自舜宇光學科技集團有限公司,型號:CX40);酶標儀(購自美國BioTek 公司,型號:Synergy NEO2);凝膠成像儀(購自德國Royal 公司,型號:Gel IX Imager)。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備

隨機挑選58 只大鼠進行造模,另選取12 只大鼠作為假手術組,參照改良Feeney 法制備腦挫傷大鼠[5],自制打擊器,將打擊器在大鼠腦表面上方垂直固定,將打擊器沿著金屬套管自30 cm 高度垂直落下打擊大鼠頭部,造成右側腦半球腦挫裂傷。 造模后2 h,待大鼠清醒后根據Longa 等[6]神經功能缺損評定標準對大鼠神經功能進行評定,將評分2~3 分大鼠納入模型,剔除操作不當、未成功大鼠,造模成功大鼠48 只。 假手術組僅打開骨窗不采取打擊器打擊。

1.3.2 動物分組與給藥

將造模成功大鼠隨機分為模型組、DAHP 組、NOS 激活劑組(BH4 組)、DAHP+BH4 組,每組12只。 DAHP 組:造模后2 h 尾靜脈注射0.5 g/kg 的DAHP[7];BH4 組:造模后2 h 尾靜脈注射0.3 mg/kg 的BH4[8],DAHP+BH4 組:造模后2 h 尾靜脈注射0.5 g/kg 的DAHP 與0.3 mg/kg 的BH4;假手術組、模型組均注射等量生理鹽水;注射體積均為10 mL/kg,各組每天給藥1 次,連續處理1 周。

1.3.3 定位航行、空間探索實驗評估大鼠行為學

末次處理后,評估大鼠行為學。 將水池4 象限中點作為入水點,將大鼠從隨意象限放入水池面對池壁,記錄大鼠尋找逃避平臺的時間,為逃避潛伏期。 撤去逃避平臺,將大鼠從原平臺對側放入水池中,連續記錄游泳120 s 內在各象限所用時間,計算原平臺象限游泳時間與逃避潛伏期比例,即為空間探索時間比例。

1.3.4 HE 染色觀察大鼠腦組織形態學變化

行為學評估結束后,將大鼠處死,獲取全腦組織,在4%多聚甲醛中過夜固定后,取損傷區,制備腦組織石蠟切片,厚度為3 μm,參考HE 染色試劑盒對切片進行染色,經乙醇脫水、二甲苯透明、樹膠封片后,在光學顯微鏡下觀察腦組織形態學變化。

1.3.5 Tunel 染色觀察腦組織細胞凋亡

制備腦組織冰凍切片,添加蛋白酶K 溶液室溫下孵育10 min,清洗后,添加TdT 緩沖液孵育20 min,避光添加Tunel 工作液孵育1 h,清洗后封片,置于熒光顯微鏡下觀察細胞染色情況。 用Image-Pro 軟件定量分析腦組織細胞凋亡率=綠色熒光細胞數/細胞總數×100%。

1.3.6 腦組織中NO 水平的測定

將腦組織剪切為碎塊后,添加9 倍體積生理鹽水,置于勻漿器內勻漿,采用Griess 法檢測腦組織NO 水平。

1.3.7 免疫印跡法檢測腦組織中蛋白表達

TRIzol 法提取腦組織總蛋白,BCA 法檢測蛋白含量,統一定量30 μg 進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳,將蛋白轉移至PVDF 膜上,經5%脫脂奶粉封閉后加入nNOS、iNOS、NF-κB、TNF-α、COX-2、 Caspase-3、 Bcl-2、 β-actin 一 抗(均 為1 ∶1000),4℃過夜孵育后,用HRP 標記二抗(1 ∶5000)37℃孵育膜2 h,添加ECL 顯色液曝光后,用凝膠成像系統采集圖像,以β-actin 作為內參,定量評估各蛋白相對表達水平。

1.4 統計學方法

采用SPSS 21.0 軟件進行數據統計分析,計量資料以平均數±標準差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗,P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠行為學比較

與假手術組相比,模型組逃避潛伏期延長,空間探索時間比例降低(P<0.05);與模型組相比,DAHP 組逃避潛伏期縮短,空間探索時間比例升高,BH4 組逃避潛伏期延長,空間探索時間比例降低(P<0.05);DAHP+BH4 組逃避潛伏期短于BH4 組,空間探索時間比例高于BH4 組(P<0.05)。 見表1。

表1 各組大鼠逃避潛伏期、空間探索時間比例比較(±s,n=12)Table 1 Comparison of escape latency and proportion of space exploration time of rats in each group

表1 各組大鼠逃避潛伏期、空間探索時間比例比較(±s,n=12)Table 1 Comparison of escape latency and proportion of space exploration time of rats in each group

注:與假手術組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05;與DAHP 組相比,cP<0.05;與BH4 組相比,dP<0.05。Note. Compared with sham operation group, aP<0.05. Compared with model group, bP < 0.05. Compared with DAHP group, cP < 0.05.Compared with BH4 group, dP<0.05.

組別Groups逃避潛伏期(s)Escape latency空間探索時間比例(%)Proportion of space exploration time假手術組Sham operation group 37.47±4.64 58.65±4.51模型組Model group 61.64±8.75a 37.18±3.46a DAHP 組DAHP group 45.24±4.68ab 44.89±3.42ab BH4 組BH4 group 72.16±7.43abc 29.87±3.41abc DAHP+BH4 組DAHP+BH4 group 62.58±8.13acd 36.11±4.38acd

2.2 DAHP 對大鼠腦組織形態學的影響

假手術組腦組織神經細胞形態正常,排列有序,細胞核著色均勻;模型組神經細胞發生腫脹、變形、細胞核固縮,著色加深,壞死細胞增多,伴有炎性細胞浸潤;與模型組相比,DAHP 組神經細胞組織形態得到一定緩解,壞死細胞減少,炎性浸潤程度減輕,BH4 組壞死神經細胞數量增多,細胞核固縮,染色變深,損傷程度加重,DAHP+BH4 組細胞形態變化不顯著。 見圖1。

圖1 HE 染色檢測腦組織形態學變化Note. A, Sham operation group. B, Model group. C, DAHP group. D, BH4 group. E, DAHP+BH4 group.Figure 1 HE staining was used to detect the morphological changes of brain tissue

2.3 DAHP 對大鼠腦組織細胞凋亡的影響

與假手術組相比,模型組大鼠腦組織細胞凋亡率升高(P<0.05);與模型組相比,DAHP 組大鼠腦組織細胞凋亡率降低,BH4 組大鼠腦組織細胞凋亡率升高(P<0.05);DAHP+BH4 組大鼠腦組織細胞凋亡率低于BH4 組(P<0.05)。 見圖2 和表2。

圖2 Tunel 染色檢測腦組織細胞凋亡情況Note. A, Sham operation group. B, Model group. C, DAHP group. D, BH4 group. E, DAHP+BH4 group.Figure 2 Tunel staining was used to detect apoptosis in brain tissue

表2 各組大鼠腦組織細胞凋亡率比較(±s,n=12)Table 2 Comparison of apoptosis rate of brain tissue in each group

表2 各組大鼠腦組織細胞凋亡率比較(±s,n=12)Table 2 Comparison of apoptosis rate of brain tissue in each group

注:與假手術組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05;與DAHP 組相比,cP<0.05;與BH4 組相比,dP<0.05。Note. Compared with sham operation group, aP<0.05. Compared with model group, bP < 0.05. Compared with DAHP group, cP < 0.05.Compared with BH4 group, dP<0.05.

組別Groups 凋亡率(%)Apoptosis rate假手術組Sham operation group 0模型組Model group 38.19±4.36a DAHP 組DAHP group 27.87±3.64ab BH4 組BH4 group 47.64±4.97abc DAHP+BH4 組DAHP+BH4 group 38.73±4.13acd

2.4 DAHP 對大鼠腦組織NOS 通路的影響

與假手術組相比,模型組大鼠腦組織nNOS、iNOS 蛋白表達、NO 水平升高(P<0.05);與模型組相比,DAHP 組大鼠腦組織nNOS、iNOS 蛋白表達、NO 水平降低,BH4 組大鼠腦組織nNOS、iNOS 蛋白表達、NO 水平升高(P<0.05);DAHP+BH4 組大鼠腦組織nNOS、iNOS 蛋白表達、NO 水平低于BH4 組(P<0.05)。 見圖3 和表3。

圖3 免疫印跡法檢測大鼠腦組織中nNOS、iNOS 蛋白表達Note. A, Sham operation group. B, Model group. C,DAHP group. D, BH4 group. E, DAHP+BH4 group.Figure 3 Western blot was used to detect the protein expression of nNOS and iNOS in rat brain

表3 各組大鼠腦組織中nNOS、iNOS、NO 水平比較(±s,n=12)Table 3 Comparison of nNOS, iNOS and NO levels in brain tissue of rats in each group

表3 各組大鼠腦組織中nNOS、iNOS、NO 水平比較(±s,n=12)Table 3 Comparison of nNOS, iNOS and NO levels in brain tissue of rats in each group

注:與假手術組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05;與DAHP 組相比,cP<0.05;與BH4 組相比,dP<0.05。Note. Compared with sham operation group, aP<0.05. Compared with model group, bP<0.05. Compared with DAHP group, cP<0.05. Compared with BH4 group, dP<0.05.

組別Groups nNOS/β-actin iNOS/β-actin NO(μmol/L)假手術組Sham operation group 0.19±0.03 0.21±0.04 1.03±0.03模型組Model group 0.38±0.05a 0.82±0.08a 1.64±0.11a DAHP 組DAHP group 0.26±0.04ab 0.51±0.05ab 1.39±0.05ab BH4 組BH4 group 0.51±0.06abc 1.04±0.13abc 1.92±0.07abc DAHP+BH4 組DAHP+BH4 group 0.40±0.05acd 0.79±0.08acd 1.62±0.12acd

2.5 DAHP 對大鼠腦組織炎性因子NF-κB、TNFα、COX-2 的影響

與假手術組相比,模型組大鼠腦組織NF-κB、TNF-α、COX-2 蛋白表達升高(P<0.05);與模型組相比,DAHP 組大鼠腦組織NF-κB、TNF-α、COX-2 蛋白表達降低,BH4 組大鼠腦組織NF-κB、TNF-α、COX-2 蛋白表達升高(P<0.05);DAHP+BH4 組大鼠腦組織NF-κB、TNF-α、COX-2 蛋白表達低于BH4組(P<0.05)。 見圖4 和表4。

圖4 免疫印跡法檢測腦組織中NF-κB、TNF-α、COX-2 蛋白表達Note. A, Sham operation group. B, Model group. C,DAHP group. D, BH4 group. E, DAHP+BH4 group.Figure 4 Western blot was used to detect the protein expression of NF-κB, TNF-α and COX-2 in brain tissue

表4 各組大鼠腦組織中NF-κB、TNF-α、COX-2 蛋白表達比較(±s,n=12)Table 4 Comparison of protein expression of NF-κB, TNF-α and COX-2 in brain tissue of rats in each group

表4 各組大鼠腦組織中NF-κB、TNF-α、COX-2 蛋白表達比較(±s,n=12)Table 4 Comparison of protein expression of NF-κB, TNF-α and COX-2 in brain tissue of rats in each group

注:與假手術組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05;與DAHP 組相比,cP<0.05;與BH4 組相比,dP<0.05。Note. Compared with sham operation group, aP<0.05. Compared with model group, bP<0.05. Compared with DAHP group, cP<0.05. Compared with BH4 group, dP<0.05.

組別Groups NF-κB/β-actin TNF-α/β-actin COX-2/β-actin假手術組Sham operation group 0.16±0.03 0.15±0.03 0.16±0.03模型組Model group 0.95±0.09a 0.61±0.07a 0.66±0.09a DAHP 組DAHP group 0.33±0.04ab 0.28±0.05ab 0.43±0.08ab BH4 組BH4 group 1.14±0.11abc 0.89±0.12abc 0.87±0.07abc DAHP+BH4 組DAHP+BH4 group 0.97±0.07acd 0.63±0.09acd 0.68±0.06acd

2.6 DAHP 對大鼠腦組織凋亡蛋白表達的影響

與假手術組相比,模型組大鼠腦組織Caspase-3蛋白表達升高,Bcl-2 蛋白表達降低(P<0.05);與模型組相比,DAHP 組大鼠腦組織Caspase-3 蛋白表達降低,Bcl-2 蛋白表達升高,BH4 組大鼠腦組織Caspase-3 蛋白表達升高,Bcl-2 蛋白表達降低(P<0.05);DAHP+BH4 組大鼠腦組織Caspase-3 蛋白表達低于BH4 組,Bcl-2 蛋白表達高于BH4 組(P<0.05)。 見圖5 和表5。

圖5 免疫印跡法檢測大鼠腦組織中凋亡蛋白表達情況Note. A, Sham operation group. B, Model group. C,DAHP group. D, BH4 group. E, DAHP+BH4 group.Figure 5 Western blot was used to detect the expression of apoptotic protein in rat brain

表5 各組大鼠腦組織中Caspase-3、Bcl-2 蛋白表達比較(±s,n=12)Table 5 Comparison of Caspase-3 and Bcl-2 protein expression in brain tissue of rats in each group

表5 各組大鼠腦組織中Caspase-3、Bcl-2 蛋白表達比較(±s,n=12)Table 5 Comparison of Caspase-3 and Bcl-2 protein expression in brain tissue of rats in each group

注:與假手術組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05;與DAHP 組相比,cP<0.05;與BH4 組相比,dP<0.05。Note. Compared with sham operation group, aP<0.05. Compared with model group, bP < 0.05. Compared with DAHP group, cP < 0.05.Compared with BH4 group, dP<0.05.

組別Groups Caspase-3/β-actin Bcl-2/β-actin假手術組Sham operation group 0.25±0.03 1.25±0.15模型組Model group 0.63±0.08a 0.41±0.06a DAHP 組DAHP group 0.45±0.05ab 0.55±0.05ab BH4 組BH4 group 0.78±0.06abc 0.22±0.03abc DAHP+BH4 組DAHP+BH4 group 0.61±0.09acd 0.42±0.05acd

3 討論

繼發性腦損傷后短時間內,腦組織中會出現的大量炎性細胞浸潤,組織中炎癥反應會進一步加重腦損傷程度,此外腦損傷后腦組織出現缺血、缺氧,造成細胞代謝異常,引發組織病理損傷,加速神經元死亡[9]。 本研究采用改良Feeney 法制備腦外傷模型大鼠,經定位航行與空間探索實驗發現模型組大鼠逃避潛伏期要顯著長于假手術組,而空間探索時間比例明顯低于假手術組,提示腦外傷導致大鼠記憶功能障礙,神經功能受損。 HE 染色發現,模型組大鼠腦組織神經細胞發生腫脹、變形、細胞核固縮,著色加深,壞死細胞增多,伴有炎性細胞浸潤,說明模型大鼠腦組織出現炎性損傷,神經細胞受損,這與以往腦外傷模型動物特征相似[10],提示模型大鼠腦組織受損,神經功能發生障礙,腦外傷大鼠模型制備成功。

NOS 信號通路與腦損傷的發生密切相關,其通過催化形成NO,發揮對腦組織神經的保護或損傷作用。 機體中的NOS 主要包括內皮型一氧化氮合酶(eNOS)、iNOS 及nNOS,過往研究發現在腦損傷早期eNOS 表達較高,通過催化生成NO 發揮對腦組織的神經保護作用,而在腦損傷中、后期nNOS、iNOS 大量表達則會釋放對腦神經有害的NO[11]。Yong 等[12]研究發現缺血再灌注損傷大鼠腦組織中eNOS 水平降低,iNOS 水平升高,給予電針治療后,能夠顯著上調eNOS,下調iNOS 水平,緩解神經功能缺損、神經元凋亡。 川芎嗪類似物CXC195 通過抑制NADPH 氧化酶和iNOS 的表達,發揮對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用[13]。 本研究發現,與假手術組相比,模型組大鼠腦組織中nNOS、iNOS 蛋白表達、NO 水平升高,提示NOS 信號通路的激活與腦外傷的發生相關。

BH4 為炎性因子及神經遞質合成的輔助因子,而GCH1 為BH4 合成主要限速酶,二者與神經損傷、疼痛的發生相關。 DAHP 為GCH1 抑制劑,可通過抑制GCH1 的合成進而降低BH4 合成,研究發現采用DAHP 能夠抑制GCH1 的表達,進而降低iNOS的表達,影響NO 的合成[14]。 近期有研究顯示DAHP 能夠通過下調iNOS 表達,進而降低腦缺血再灌注損傷大鼠梗死面積,減輕腦水腫,發揮對腦組織的保護作用[15]。 Li 等[16]研究發現DAHP 通過抑制凋亡和激活磷脂酰肌醇-3 激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路對發揮對局灶性腦缺血的保護作用[16]。 本研究發現采用BH4 處理模型大鼠后,逃避潛伏期延長,空間探索時間比例降低,腦組織損傷程度加重;而采用BH4 聯合DAHP 處理模型大鼠后,與BH4 組比較,大鼠逃避潛伏期縮短,空間探索時間比例升高,腦組織損傷程度有所緩解,提示DAHP 可通過抑制iNOS 信號通路的表達,進而緩解腦外傷大鼠腦組織神經損傷。 在腦損傷后過量炎癥反映會導致COX-2、iNOS 表達升高,過往研究發現在腦損傷后24 h 內,COX-2 達到最大值,其水平與病情嚴重程度密切有關[17]。 此外腦損傷后NF-κB 表達大量升高,進一步刺激iNOS 合成大量的NO,上調促炎癥因子TNF-α 表達,加重炎癥損傷[18]。 本研究發現模型組大鼠腦組織中COX-2、NF-κB、TNF-α 蛋白表達明顯升高,給予BH4 后能夠進一步升高上述炎癥因子的表達,聯合DAHP 后則能抑制上述炎癥因子的表達,提示DAHP 可能通過抑制NOS 表達進而緩解對腦外傷大鼠炎癥損傷。

神經細胞凋亡參與腦損傷的發生、發展過程,細胞凋亡數量的多少,與損傷嚴重程度密切相關[19]。 本研究通過Tunel 染色檢測發現,模型組大鼠腦組織中神經細胞凋亡率明顯升高,給予BH4 處理后細胞凋亡加重,聯合DAHP 處理后細胞凋亡降低,提示DAHP 可通過減輕神經細胞凋亡,保護腦組織。 Caspase-3 是細胞死亡的最終執行者,而Bcl-2 作為抗凋亡蛋白能夠抑制Caspase-3 激活,阻斷Bax 等凋亡蛋白的激活,研究發現腦損傷后24 h Caspase-3 表達達到最高峰,而Bcl-2 表達則最低[20]。 本研究發現模型組大鼠腦組織中Caspase-3蛋白表達升高,Bcl-2 蛋白表達降低,給予BH4 后能夠Caspase-3 蛋白表達進一步升高,Bcl-2 蛋白表達進一步降低,聯合DAHP 后Caspase-3 蛋白表達降低,Bcl-2 蛋白表達升高,提示DAHP 可能通過抑制凋亡蛋白激活,發揮抗凋亡作用,保護腦外傷大鼠神經功能。

綜上所述,DAHP 能夠緩解腦外傷大鼠腦組織神經細胞凋亡,降低炎性損傷,緩解神經功能障礙,其機制可能與抑制iNOS 信號通路有關。 然而本研究也存在不足,腦外傷機制較復雜,DAPH 是否還通過其他途徑發揮對腦組織神經保護作用,尚待后續深入探究。