PRP 明膠微球對大鼠壓力性尿失禁的治療作用

周謀 林放 李文丹 孫宇 單桂秋 施琳穎

隨著二胎政策的放開,女性產后出現的一系列的問題逐漸受到了廣泛的關注。其中SUI 作為一種影響生活質量的產后常見病,會給患者帶來嚴重的生理和心理影響［1］。SUI 主要的臨床表現為咳嗽、打噴嚏等腹壓突然增加時,尿液不自主地流出。這種疾病雖然對生命不會造威脅,但給女性的身心健康以及生活質量帶來了嚴重的影響［2,3］。外科手術是治療SUI 最有效也是最快捷的方式之一,但外科手術有其局限性,比如對固有尿道括約肌功能障礙的患者,手術就不是最有效的方法,而且操作時常會伴隨尿路感染、膀胱損傷、排尿功能障礙、發熱等手術并發癥,因此,使用注射療法治療SUI,成為了臨床醫生關注的焦點。本研究通過建立大鼠壓力性尿失禁模型,并在大鼠尿道中段注射PRP 明膠微球,觀察其在壓力性尿失禁模型大鼠中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 成年雌性SD 大鼠32 只,體重為220～250 g,實驗動物許可證號：SCXK(粵)2011-0015。實驗動物由南方醫科大學動物實驗中心提供,符合動物倫理學要求。

1.1.2 主要設備 真空冷凍干燥機(廣州倍立思儀器有限公司,型號Alphal-4 LSC Plus)、生物安全柜(廣州市蘇泰空調凈化設備有限公司,型號AIRTECH)、水浴兩用振蕩器(上海悅豐上海悅豐儀器儀表有限公司,型號SH2B)、TCH 純水機(杭州天創凈水設備有限公司,型號TCH-RO/20)、磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限公司,型號DH-101S)、電子精密天平(德國Sartorius公司,型號BS124S)等。

1.1.3 主要材料 PRP(本研究團隊自制)、固體明膠［西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司,G7041-500G,批號1002047083］；Span 80(天津恒興化學試劑廠,批號 20150107,化學純)、25%戊二醛(國藥集團化學試劑有限公司,批號20150617,化學純)、異丙醇(廣州化學試劑廠,批號20150910-2,分析純)、丙酮(廣州化學試劑廠,批號20150209,分析純)、石油醚(天津市百世化工有限公司,批號GB/T 15894-2008,分析純)、液體石蠟(山東利爾康醫療科技股份有限公司,批號141119,化學純)等。

1.2 方法

1.2.1 空白明膠微球制備

1.2.1.1 將3.0 g 固體明膠加入20 ml 的蒸餾水中,在50℃條件下攪拌溶解。完全溶解后,放置在50℃水浴箱中進行孵育,待用。

1.2.1.2 將1.5 ml Span 80 加入100 ml 的液體石蠟中混勻。將50℃恒溫磁力加熱攪拌器轉速調為750～825 r/min 后,將上述混合物置于攪拌器中攪拌,并緩慢加入明膠溶液,乳化10 min。

1.2.1.3 乳化后快速將上述混合物轉入到冰水浴中,將溫度速降至4℃后,繼續攪拌15 min。

1.2.1.4 加入適量25%戊二醛預固化5 min,加入100 ml 25%戊二醛,4℃冰箱放置24 h。

1.2.1.5 24 h 后取出倒掉上清,加入100 ml 異丙醇脫水2 h。

1.2.1.6 按照丙酮、異丙醇、石油醚洗滌的順序,交替洗滌3 次,用真空抽濾機進行抽濾。將抽濾后的沉淀物放置于60℃干燥箱中干燥,即得到空白明膠微球。

1.2.2 PRP 明膠微球制備

1.2.2.1 將100 U/ml 凝血酶和100 mg/ml 的葡萄糖酸鈣溶液混合,制備成PRP 激活劑。

1.2.2.2 將凍存PRP 與血小板激活劑按體積比10∶1混合,置于37℃水浴箱中水浴30 min 后在220 g 條件下離心20 min,取上清即得到富血小板凝膠(PG)上清。

1.2.2.3 將100 μl PG 上清加至裝有10 mg 空白明膠微球的無菌EP管中,充分混勻后置于4℃冰箱浸潤24 h。

1.2.2.4 充分浸潤后,將EP 管置于-80℃超低溫冰箱中預凍過夜。

1.2.2.5 次日先將真空冷凍干燥機冷阱溫度降至-46℃,溫度達到后將EP 管移入真空冷凍干燥機進行真空干燥(真空度＜133 mbar)24 h 后,隨后取出待用。使用時用生理鹽水按體積比1∶1 混合制成PRP 明膠微球溶液。

1.2.3 壓力性尿失禁大鼠模型的建立

1.2.3.1 SD 大鼠麻醉后,將不同型號的擴張器依次插入大鼠陰道內,當型號為34 F 的擴張器能無阻力進入大鼠的陰道后,取出擴張器。在陰道內插入末端為球囊的導管后,在陰道外口進行縫合。

1.2.3.2 縫合完畢后,在球囊內緩慢注射3 ml 的生理鹽水,使球囊一直屬于極度擴張狀態,并開始計時。見圖1。

圖1 大鼠陰道擴張操作圖

1.2.3.3 擴張4 h 后,將球囊內的生理鹽水緩慢放出。待生理鹽水排空后,剪開陰道外口的縫線取出導管。

1.2.3.4 對SD 大鼠行噴嚏實驗,驗證壓力性尿失禁大鼠造模成功。

1.2.3.5 將32 只陰道擴張大鼠隨機分為4組,每組8 只：A 組為假手術對照組(空白對照組)、B 組為生理鹽水組(對照組1)、C 組為空白明膠微球組(對照組2)、D 組為PRP 明膠微球組(實驗組)。用剃毛器將下腹部皮膚的毛發剃光,使用無菌棉球進行碘伏消毒后,用無菌刀片在下腹部行正中切口,切口長度約1 cm。依次切開皮膚、腹壁層后,暴露尿道和膀胱頸部。

1.2.3.6 假手術對照組切開下腹部暴露膀胱和尿道后,不注射任何物質后,直接關閉腹壁。其余三組用微量注射器吸取各組溶液,分別于距膀胱0.5 cm 處的尿道近腹端3 點和9點的位置進針,每一側都同時注射100 μl 各組溶液,進針角度為30°,使局部隆起一小丘后留置針頭約5 s,再慢慢地拔出針頭。

1.2.3.7 手術后3、5、7、14、21 d 進行HE 染色和Masson 染色。

1.3 觀察指標 觀察各組造模結果、HE 染色和Masson 染色結果。

2 結果

2.1 造模結果 32 只SD 大鼠噴嚏實驗陽性為28 只,成功率為 88%(28/32),4 只在噴嚏實驗時出現逼尿肌不穩定性收縮。假手術對照組分配2 只噴嚏實驗陰性大鼠、生理鹽水組、空白明膠微球組和PRP 明膠微球組各分配1 只。

2.2 HE 染色結果 由結果可知,A、B、C 組平滑肌排列稀疏,肌肉束的間隔增大；D 組平滑肌排列較整齊,肌肉束的間隔較致密。見圖2A-D。

2.3 Masson 染色結果 由結果可知,A、B、C 組可明顯地觀察到尿道外括約肌有廣泛的斷裂,肌肉排列紊亂；A、B 組無明顯膠原纖維(藍色)沉積,C 組可見膠原纖維沉積。D 組肌肉排列較完整,且膠原纖維沉淀明顯。見圖2E-H。

圖2 21 d 病理染色結果圖

3 討論

SUI 主要治療方式為保守治療和手術治療,但近年來,利用微創手術治療SUI 得到了快速發展,其中注射治療受到關注。有研究證明,注射單一生長因子可促進體外培養的SUI 患者的肛提肌成肌細胞增殖［4］。

SUI 患者的盆底損傷、退化松弛或功能缺陷與膠原蛋白的代謝和異常有著密切的關聯,膠原含量的降低,直接引起了盆底支持的組織彈性減弱,從而導致盆底松弛。轉化生長因子-β1(TGF-β1)作為盆底組織最重要的保護性因子之一,與膠原的合成、降解有著直接的關系。TGF-β1含量的高低,直接影響了基質降解酶及其抑制因子的數量與活性,在盆底支持組織損傷的修復過程中,起著關鍵性的修復作用［5,6］。

PRP 是自體全血通過離心后獲得的高濃度血小板的血液制品,使用凝血酶和鈣離子共同激活后,可形成PG。該凝膠和其上清均可以釋放多種促進創面修復的生長因子,如轉化生長因子-β1、表皮生長因子、胰島素樣生長因子、成纖維細胞生長因子等。這些生長因子有相互的協同作用,共同促進著創面的修復和愈合［7,8］。PRP 在改善卵巢功能方面有著優良的表現,可有效增加子宮內膜厚度［9］、恢復卵巢儲備功能［10］和調節性激素水平［11］,因此受到了婦產科醫生們的廣泛關注。明膠作為膠原的降解產物,是動物的皮、骨等結締組織中膠原經部分水解和熱變性而成的大分子蛋白質,其理化性能好,安全無毒且生物相容性好,已成為了控釋劑的理想載體［12］。有研究表明載IGF-1 的明膠微球,能有效促進受損的尿道括約肌的恢復及血管再生,可明顯提高大鼠的尿控功能以及改善組織結構［13,14］。為此,本課題組將PRP 和明膠微球聯合應用,研制出了一種可緩釋多種生長因子的明膠微球。從病理實驗結果可以看出,假手術對照組、生理鹽水組和空白明膠微球組可以看到尿道外括約肌損傷較嚴重,平滑肌排列稀疏,肌肉束的間隔增大,數量也相應減少。而PRP 明膠微球組的尿道外括約肌的層數比其他組有明顯的恢復,尿道外括約肌的形態結構也相對完整。

綜上所述,PRP 明膠微球除緩釋效果和安全性良好外,其促進組織和細胞恢復的效果也較好,有望成為未來治療SUI 的一種新方法,下一步我們將繼續研究其使用的適應證、最佳的注射劑量、部位及時間,為治療SUI 提供新思路。