豬流行性腹瀉病毒GDsg株的分離鑒定及遺傳進化分析

董建國 ， 饒 丹 ， 陳明睿 ， 何書海 ， 焦鳳超 ， 陳 斌 ， 易本馳 ， 黃 立 ， 趙攀登

(1.信陽農林學院牧醫工程學院 ， 河南 信陽 464000 ； 2.河南牧業經濟學院動物醫學院 ， 河南 鄭州 450046)

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一種腸道致病性疾病，其臨床主要表現為腹瀉、嘔吐和脫水，以及造成小腸腸道擴張，腸絨毛萎縮、脫落，腸壁彈性消失等病理變化[1]。該病對哺乳仔豬致死性高，死亡率可達100%[2-3]。1971年，英國首次暴發PED，隨后在歐洲和亞洲許多國家相繼報道[4]。2010 年，PEDV變異毒株在我國出現，給我國養豬業造成重大損失[5]。

PEDV屬于尼多病毒目(Nidovirales)冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒屬(Coronavirus) α冠狀病毒亞屬，為單股正鏈RNA病毒[6]。PEDV全基因組約為28kb，依次由5′端帽子結構(Cap)、7個開放閱讀框(Open reading fragment,ORFs) 以及含PolyA尾的3′端組成[7]。7個ORFs編碼情況為：ORF1a和ORF1b位于5′端后，約占全基因組的2/3，編碼非結構蛋白；其余5個開放閱讀框依次為S基因編碼結構蛋白S(Spike)、ORF3基因編碼非結構蛋白ORF3、E基因編碼包膜蛋白E、M基因編碼膜蛋白M、N基因編碼核衣殼蛋白N[8]。S蛋白表面包含多種抗原表位，在病毒識別進入宿主細胞中具有重要作用[9-10]。具有代表性的抗原表位主要為：中和抗原表位COE(499～638 aa)、2個B細胞抗原表位S1D5(744～759 aa)和S1D6(756～771 aa)、2個線性抗原表位SS2(748～755 aa)和SS6(764～771 aa)[11]。基于S基因的同源性分析可將其分為S1和S2兩個區域。S基因具有很強的變異性，且其變異性主要集中在S1的N端，根據其變異性可將PEDV分為經典型和變異型2種類型[12]。因此，S基因在PEDV的研究中具有重要意義，其被廣泛地應用于亞單位疫苗、基因工程疫苗及PEDV抗體檢測試劑盒的研發當中。

為了解我國廣東地區PEDV的流行及變異情況，本實驗室于2015年1月從廣東省韶關市某中大型養豬場大面積暴發仔豬腹瀉死亡的腸道及糞便樣本中檢測出PEDV陽性，并成功在Vero細胞上分離出PEDV毒株并命名為GDsg株。通過對其全基因測序并與其他PEDV代表性毒株進行序列比對及進化樹分析，進而分析其與我國現流行毒株的相似性，從而了解廣東省PEDV的流行趨勢。

1 材料與方法

1.1 病料采集 廣東省韶關市2015年疑似暴發PEDV某豬場自然發病仔豬，采集小腸及內容物于-80 ℃儲存。

1.2 細胞、菌體及載體 本試驗使用Vero細胞由華南農業大學國家生豬種業工程技術研究中心豬病防控研究室保存；克隆宿主菌Trans5α化學感受態細胞和pEASY-Blunt Simple Cloning Kit?克隆載體，均購自北京全式金生物技術有限公司。

1.3 試劑 病毒DNA/RNA提取試劑盒，購自廣州Magen公司；反轉錄試劑盒和Wizard SV Geland PCR Clean-Up System 膠回收試劑盒，均購自Promega公司；DNA Marker DL2 000，購自廣州東盛生物科技有限公司；EB替代染料，購自廣州華奇盛有限公司；全基因序列擴增高保真酶PrimeSTAR?HS DNA Polymerase，購自TaKaRa生物工程公司；DMEM細胞培養液、澳洲胎牛血清、雙抗、無EDTA胰酶，均購自Thermo Fisher生物公司。

1.4 引物設計合成 根據GenBank上發布的PEDV序列，通過生物信息學分析選取S基因保守區間設計特異性鑒定引物(表1)對PEDV進行鑒定。并根據已發表的CV777毒株等PEDV全基因序列及參考相關文獻設計用于PEDV全基因擴增的14對引物[13](表2)。引物均由生工生物工程上海(股份)有限公司合成。

1.5 病料處理及PCR檢測 將采集的發病仔豬小腸及內容物剪碎，加入1 mL PBS研磨，研磨液移至1.5 mL離心管中。4 ℃下12 000 r/min離心10 min，取上清液于0.22 μm 微孔濾器過濾除菌。取濾液220 μL用于病毒DNA/RNA的提取，剩余濾液存儲于-80 ℃中。對提取的病毒核酸進行有關PEDV、PRRSV、PPV和CSFV的RT-PCR檢測以及PRV、PCV2和PCV3的常規PCR檢測。

1.6 病毒分離純化及間接免疫熒光試驗 在37 ℃含5% CO2細胞培養箱下使用12孔細胞培養板培養Vero細胞，待細胞長至單層鋪滿時棄上清，PBS洗3次，接種50 μL濾膜過濾無菌的病料研磨液，加入100 μL無血清、含2%雙抗的DMEM培養液，37 ℃ 5% CO2細胞培養箱下培養，72 h后約90%細胞出現明顯細胞病變效應(CPE)。收集細胞并對細胞反復凍融3次，離心后棄掉細胞碎片，將收集的病毒進行蔗糖密度梯度離心純化，并存儲于-80 ℃。為了進一步鑒定出現CPE的細胞感染了PEDV，同時將做的重復孔細胞用無水乙醇固定20 min，PBS洗滌3次，每次3 min；加入抗PEDV M蛋白單克隆抗體，室溫孵育1 h；PBS洗滌3次，每次3 min；加入FITC標記的二抗，避光，室溫孵育1 h；PBS洗滌3次，每次3 min；加入熒光猝滅劑，制作片子并在熒光顯微鏡下觀察。

1.7 病毒接毒傳代 在37 ℃含5% CO2細胞培養箱下使用25 mL細胞培養瓶培養Vero細胞。待細胞長至單層鋪滿時棄上清，PBS洗3次，接種200 μL病毒液，加入100 μL無血清、含2%雙抗的DMEM維持液5 mL，置于37 ℃ 5% CO2細胞培養箱中培養。3～5 d后約90%細胞出現明顯CPE。反復凍融3次收樣并存儲于-80 ℃。重復此方法對病毒進行傳代。

1.8 病毒RNA提取及反轉錄 取在Vero細胞上分離到的第3代GDsg株200 μL，根據 Magen 公司產品試劑盒進行病毒核酸提取，然后根據Promega 反轉錄試劑盒對所提取的病毒核酸進行反轉錄。

1.9 PEDV GDsg株全基因組擴增 使用 TaKaRa 生物工程公司PrimeSTAR?HS DNA Polymerase高保真酶對目的片段進行擴增。擴增體系為 50 μL：PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μL，5×PrimeSTAR Buffer 10 μL，dNTP Mixture 4 μL，cDNA 模板 4 μL，上游引物 2 μL，下游引物 2 μL，RNase Free H2O 27.5 μL。PCR 擴增程序：98 ℃預變性 2 min；98 ℃變性 10 s，56 ℃退火 60 s，72 ℃延伸 30 s/kb，35 個循環；72 ℃延伸 10 min。將 PCR 產物進行 1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.10 PEDV GDsg株全基因組測序 PCR 擴增產物通過 1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，使用膠回收試劑盒對目的片段進行膠回收。然后連接到pEASY-Blunt Simple Cloning Vector 上。經過轉化挑菌鑒定后送往測序公司進行測序。

1.11 序列比對分析 利用 DNASTAR.Lasergene.v 7.1、Mega 5.0及Clustal X 軟件將分離的毒株全基因組與國內外分離毒株進行序列比對并構建進化樹，并分別將S基因序列和氨基酸序列與其他國內外代表毒株的S基因序列和氨基酸序列進行比對分析。PEDV 代表毒株基因序列均來源于GenBank。

2 結果

2.1 病料樣品RT-PCR檢測 使用PEDVS基因檢測引物S1將采集樣品處理好后提取核酸進行RT-PCR檢測，通過瓊脂糖凝膠電泳證明檢測結果為陽性(圖1)。

圖1 PEDV S基因的擴增Fig.1 Amplification of PEDV S geneM：DNA分子質量標準； 1：樣品； 2：陰性對照M:DNA marker DL2 000; 1：Sample; 2:Negative control

2.2 病毒分離純化與鑒定 將處理好的病料濾液接種至Vero細胞上，傳代培養至第4代，Vero細胞出現明顯CPE時進行免疫熒光鑒定，結果顯示接毒組細胞出現特異性的熒光(圖2)，表明病毒分離成功。收集細胞液進行蔗糖密度梯度離心純化，將純化獲得的病毒提取核酸進行全基因測序。

圖2 PEDV致Vero細胞病變Fig.2 Cytopathic effect of PEDV on Vero cellA：正常細胞； B：接種病豬腸道內容物的細胞A:Normal cell; B:Cells inoculated with intestinal contents of diseased pigs

2.3 PEDV GDsg株全基因進化樹構建分析 運用生物進化分析軟件Mega 5.0和Clustal X對GDsg株進行全基因進化樹構建(圖3)。進化樹構建所使用國內外參考毒株均從GenBank上下載。如圖3進化樹分析所示，分離株GDsg株與GII型GIIa亞型的代表毒株AJ1102距離較近，應屬于GII型GIIa亞型毒株，屬于流行變異毒株。

圖3 PEDV GDsg株全基因組進化樹分析Fig.3 Analysis of whole-genome evolutionary tree of PEDV GDsg strain●：本試驗分離的毒株●:The strains isolated in this experiment

2.4 PEDV GDsg株全基因組同源性分析 運用生物進化分析軟件DNASTAR.Lasergene.v 7.1中的MegAlign對PEDV GDsg株進行全基因組同源性進化分析(圖4)。GDsg株與經典株GIa亞型代表毒株CV777的同源性為96.6%，同源性最低；與經典株GIb亞型代表毒株attenuated DR13同源性為97.1%；與變異株GIIa亞型代表毒株GHGD-01同源性為98.2%，同源性最高。此結果進一步證明GDsg株屬于變異株GIIa亞型毒株。

圖4 PEDV GDsg株全基因組同源性分析Fig.4 Homology analysis of whole-genome of PEDV GDsg strain

2.5 PEDV GDsg株S基因氨基酸抗原表位分析 運用生物進化分析軟件DNASTAR.Lasergene.v 7.1中的MegAlign對PEDV GDsg株的S基因氨基酸序列進行比對分析。結果顯示，與經典株GIa亞型代表毒株CV777相比，在中和抗原表位COE區間GDsg有6個氨基酸突變，分別為522(A/S)、526(H/Y)、554(T/S)、599(G/S)、634(P/T)和638(Q/E)，無氨基酸插入和缺失；在線性表位SS2區間GDsg無氨基酸突變、插入和缺失；在線性抗原SS6區間GDsg有1個氨基酸發生突變，為769(L/S)，無氨基酸插入和缺失。

3 討論

自1971年PED首次感染育肥豬在英國報道后，很快就傳播至歐洲其他國家及亞洲國家[3]。2010年10月，變異型PEDV毒株在我國南方出現并迅速傳播至全國各地，造成大面積哺乳仔豬死亡，死亡率高達80%～100%，給我國養豬業造成重大經濟損失[5]。目前，PEDV的防控主要通過疫苗免疫和生物安全兩方面來進行。用于PEDV防控的疫苗有基于經典毒株和變異毒株的滅活疫苗、弱毒疫苗、亞單位疫苗等多種，但至今尚無有效的疫苗能夠控制PEDV的傳播。另一方面，由于PEDV為RNA病毒，疫苗的混亂使用反而加劇其不斷變異的可能性，這也可能是造成2010年變異毒株出現的原因，也使得PEDV的防控更加艱難[14-15]。

本試驗在Vero細胞中成功分離出PEDV GDsg毒株，通過RT-PCR進行全基因序列的分段擴增并克隆至測序載體上進行全基因測序。最后通過生物學進化分析軟件，與GenBank上已發布的相關PEDV毒株進行基因進化分析及同源性分析。分析結果顯示，GDsg株與PEDV變異株GIIa亞型代表毒株AJ1102同源性最高，為98.3%，且進化分析位于同一分支上。表明PEDV在廣東地區變異毒株流行，給養豬業造成防控壓力，并隨著其傳播有增大PEDV變異的可能性。

PEDV變異毒株的出現主要是由于S基因的變異所造成的。S基因編碼的蛋白成為纖突蛋白，位于病毒粒子的最外層，為I型跨膜糖蛋白。由于其位于病毒粒子的最外層，PEDV的抗原表位主要集中在S蛋白表面[16-17]。通過對S蛋白氨基酸序列比對分析得出，與經典毒株CV777相比，GDsg株在中和抗原表位COE區間有6個氨基酸的發生突變，分別為A522S、H526Y、T554S、G599S、P634T和Q638E；在線性抗原表位SS6區間有1個氨基酸發生突變，為L769S。這些突變可能會影響免疫原性，從而導致疫苗免疫失敗，造成PED的暴發，進而造成更大的變異。

本試驗結果表明，GDsg株為PEDV變異株GIIa亞型毒株。通過對GDsg株的測序比對分析，一方面可對廣東省PEDV的流行狀況進行了解，根據其變異趨勢提出合理有效地防控方案；另一方面可根據其抗原表位的突變情況設計相應合理的亞單位疫苗方案，從而有效地阻止PEDV的傳播。