頂空氣相色譜法測(cè)定加米霉素原料藥的殘留溶劑

岳永波 ， 范小平 ， 李偉嶺 ， 楊 芳 ， 劉 波 ， 吳鵬飛 ， 羅 妍 ， 趙 盼 ， 王金陽(yáng)

(1.保定冀中藥業(yè)有限公司 ， 河北 保定 071500 ； 2.石家莊冀中藥業(yè)有限公司 ， 河北 石家莊 050066 ；3.海南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ， 海南 ?？?571100)

加米霉素(Gamithromycin)是新一代半合成、十五元氮雜大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥，由法國(guó)梅里亞公司(Merial)開(kāi)發(fā)成獸用注射液(商品名Zactran?)，分別于2007年、2010年和2011年被歐洲藥品局(EMA)、加拿大保健產(chǎn)品與食品管理局(HPFB)和美國(guó)食品與藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)用于防治溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌與睡眠嗜組織菌引起的牛呼吸系統(tǒng)疾病。2016年，EMA將加米霉素注射液的適用范圍擴(kuò)展至豬、綿羊，用于防治由胸膜肺炎放線桿菌、多殺性巴氏桿菌與豬嗜血桿菌引起的豬呼吸系統(tǒng)疾病和由惡性節(jié)瘤偶蹄形菌與壞死梭桿菌引起的綿羊腐蹄病[1-4]。近年來(lái)，我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部陸續(xù)批準(zhǔn)了數(shù)家國(guó)內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)的該產(chǎn)品用于牛、豬的臨床應(yīng)用。

加米霉素原料藥生產(chǎn)過(guò)程中使用了甲醇、乙醇、正丙醛、二氯甲烷和正庚烷等有機(jī)溶劑[5-13]，為了有效控制藥品質(zhì)量，確保用藥安全，結(jié)合生產(chǎn)工藝并參照《中國(guó)獸藥典》對(duì)各溶劑殘留量的要求和測(cè)定的相關(guān)文獻(xiàn)[14-15]，建立一種測(cè)定加米霉素原料藥溶劑殘留的可靠、有效方法至關(guān)重要。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 Agilent 7890A氣相色譜儀，Agilent 7694E頂空進(jìn)樣器，氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)，Chemstation數(shù)據(jù)工作站，BSA224S-CW型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]。

1.2 主要試劑 甲醇、乙醇、正丙醛、二氯甲烷和正庚烷(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；N，N-二甲基甲酰胺(DMF，色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；加米霉素(批號(hào)：190524、190601、190609，山東魯抗舍里樂(lè)藥業(yè)有限公司)。

1.3 色譜條件 色譜柱為Agilent DB-624石英毛細(xì)管柱(30.0 m×0.53 mm，3.0 μm)；初始柱溫為40 ℃，保持5 min，以10 ℃/min的速率升溫至100 ℃， 然后以20 ℃/min的速率升溫至200 ℃，保持3 min；進(jìn)樣口溫度為150 ℃，檢測(cè)器溫度為250 ℃； 載氣為氮?dú)?，流速?.5 mL/min；分流比為10∶1。頂空進(jìn)樣，頂空瓶平衡溫度為70 ℃，平衡時(shí)間為10 min；定量環(huán)溫度為80 ℃；傳輸線溫度為90 ℃。

1.4 溶液的配制

1.4.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液 分別精密稱取適量甲醇、乙醇、正丙醛、二氯甲烷和正庚烷至不同容量瓶中，用DMF稀釋至刻度，制成濃度分別約為30、50、50、6 mg/mL 與50 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取各對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，DMF稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

1.4.2 混合對(duì)照品溶液 精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0 mL置于10 mL容量瓶，用DMF稀釋至刻度，搖勻，即得?；旌蠈?duì)照品溶液中甲醇、乙醇、正丙醛、二氯甲烷和正庚烷的濃度分別約為0.3、0.5、0.5、0.06 mg/mL與0.5 mg/mL。

1.4.3 供試品溶液 取加米霉素約0.5 g，精密稱定，置20 mL頂空瓶中，精密加入DMF 5 mL，搖勻，密封，即得。

1.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取空白溶劑DMF及“1.3”配制的混合對(duì)照品溶液與供試品溶液，按照“1.2”色譜條件分別進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。

1.6 線性關(guān)系考察 精確量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.3、0.5、0.8、1.0、1.2 mL和1.5 mL(對(duì)應(yīng)限度濃度的30%、50%、80%、100%、120%和150%)，分別置于10 mL容量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，制得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密量取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各5 mL至20 mL頂空瓶中，密封，按照“1.2”色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標(biāo)，各對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸并計(jì)算各成分的回歸方程。

1.7 檢測(cè)限與定量限 取對(duì)照品儲(chǔ)備液，用DMF進(jìn)行逐級(jí)稀釋，按照“1.2”色譜條件進(jìn)樣分析，以信噪比S/N=10的濃度為定量限，以信噪比S/N=3的濃度為檢測(cè)限。

1.8 精密度試驗(yàn) 精確量取混合對(duì)照品溶液5 mL置20 mL頂空瓶中，密封，量取6份平行精密度試驗(yàn)溶液。按照“1.2”色譜條件依次進(jìn)樣，記錄各平行樣品中各溶劑的峰面積，計(jì)算各溶劑峰面積的RSD。

1.9 加樣回收率試驗(yàn) 取加米霉素(批號(hào)：190609)約1.0 g，精密稱定9份，分別置10 mL容量瓶中，精確加入混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.8、1.0 mL和1.2 mL，用DMF溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得80%、100%、120%限度濃度的回收溶液，每一濃度回收溶液平行配制3份。精確量取各回收溶液5 mL 置20 mL頂空瓶中，密封，按照“1.2”色譜條件依次進(jìn)樣分析，計(jì)算各溶劑的回收率及RSD。

1.10 樣品測(cè)定 取3批加米霉素(批號(hào)：190524、190601和190609)，按照“1.3”配制混合對(duì)照品溶液與供試品溶液，按照“1.2”色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算樣品中各溶劑的殘留量。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適用性 由圖1～3和表1可知，空白溶劑DMF對(duì)檢測(cè)無(wú)干擾，理論板數(shù)與分離度均符合測(cè)定要求，分離度良好。

圖1 空白溶劑(DMF)色譜圖Fig.1 Blank solvent (DMF) chromatogram

圖2 混合對(duì)照品溶液色譜圖Fig.2 Mixed reference solution chromatogram1:甲醇; 2:乙醇; 3:正丙醛; 4:二氯甲烷; 5:正庚烷1:Methanol; 2:Ethanol; 3:n-Propanal; 4:Dichloromethane; 5:n-Heptane

圖3 供試品溶液色譜圖Fig.3 Test solution chromatogram1:甲醇; 2: 正庚烷1:Methanol; 2:n-Heptane

表1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 System suitability test results

2.2 線性范圍 由表2可知，5種待測(cè)殘留溶劑在規(guī)定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 殘留溶劑的線性方程與相關(guān)系數(shù)Table 2 Linear equations and related parameters of residual solvents

2.3 檢測(cè)限與定量限 各溶劑分別以信噪比約為3∶1與10∶1對(duì)應(yīng)的濃度為檢測(cè)限與定量限，結(jié)果見(jiàn)表3。各待測(cè)溶劑的檢測(cè)限均低于原料藥中相應(yīng)溶劑殘留限度要求，該法可用于甲醇、乙醇、正丙醛、二氯甲烷和正庚烷5種溶劑殘留的測(cè)定。

表3 殘留溶劑的檢測(cè)限與定量限Table 3 Detection limits and quantitative limits of residual solvents (μg/mL)

2.4 精密度 甲醇、乙醇、正丙醛、二氯甲烷和正庚烷的峰面積RSD(n=6)分別為2.82%、2.11%、0.70%、2.07%和1.73%，均小于10%，說(shuō)明該分析方法精密度良好。

2.5 加樣回收率 回收率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，各溶劑的回收率均在98%～104%，RSD(n=9)均小于5.0%，表明該法準(zhǔn)確度良好。

表4 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)Table 4 Test results of sample recovery (n=9，%)

2.6 樣品測(cè)定 測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5，3批樣品的殘留溶劑含量均未超過(guò)《中國(guó)獸藥典》相應(yīng)的限度規(guī)定。

表5 樣品測(cè)定結(jié)果Table 5 Determination results of sample (%)

3 討論

藥物中的殘留溶劑存在改變某些藥物晶型、增加引濕性、影響藥物質(zhì)量等潛在風(fēng)險(xiǎn)，尤其是殘留溶劑的毒性及致癌作用日益引起重視。中國(guó)獸藥典和人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)(ICH)對(duì)各類溶劑的殘留量均有嚴(yán)格規(guī)定。為了有效控制藥品質(zhì)量、保證用藥安全，在盡量除去殘留溶劑的基礎(chǔ)上，對(duì)其成分及限量進(jìn)行檢測(cè)與控制亦尤為重要。據(jù)《中國(guó)獸藥典(2015年版)》附錄“殘留溶劑測(cè)定法”，進(jìn)樣方式分為頂空進(jìn)樣與溶液直接進(jìn)樣兩種[16]。頂空進(jìn)樣法一般適用于測(cè)定沸點(diǎn)較低、易揮發(fā)的溶劑，與溶液直接進(jìn)樣法相比，氣化后殘留溶劑的濃度有所提高，可減少溶解樣品的高沸點(diǎn)溶劑(如DMF)的進(jìn)樣量及避免樣品污染色譜系統(tǒng)。5種待測(cè)殘留溶劑均具有沸點(diǎn)較低、易揮發(fā)的性質(zhì)，更適宜采用頂空進(jìn)樣的方式。

此外，考察了該方法色譜條件發(fā)生微小變化的耐受程度，對(duì)流速(2.5±0.2) mL/min、初始柱溫(40±2) ℃、進(jìn)樣口溫度(150±5) ℃與檢測(cè)器溫度(150±5) ℃進(jìn)行研究，結(jié)果表明各溶劑的理論塔板數(shù)、分離度及回收率均符合要求，該方法耐用性良好。本試驗(yàn)建立的頂空氣相色譜法檢測(cè)加米霉素原料藥中殘留溶劑的方法，專屬性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確度與耐用性良好，是加米霉素原料藥殘留溶劑測(cè)定的一種有效方法。