GLP-1受體激動劑對糖尿病動脈粥樣硬化大鼠microRNA-155及Toll樣受體4表達的影響*

郭麗婷 葛煥琦 鄭 輝 王 帆 劉天文

泰達國際心血管病醫院,天津市 300457

心肌梗死、卒中等動脈粥樣硬化事件是2型糖尿病患者最主要的死亡原因。近年來，研究顯示炎癥在動脈粥樣硬化的發病機制中起著重要作用。其中，microRNA-155(miR-155)作為典型的多功能miRNAs分子之一，在炎癥、免疫的調控中發揮重要作用。胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)受體激動劑利拉魯肽作為降糖藥已廣泛應用于臨床。最新研究顯示，利拉魯肽在改善血糖外亦有多種獲益，引起學術界的重點關注。研究顯示，利拉魯肽可以改善糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠的胰島素抵抗并減輕肝臟氧化應激損傷[1]。另一研究顯示，利拉魯肽可以減輕糖尿病小鼠動脈粥樣硬化病變程度[2]。目前，利拉魯肽在改善動脈粥樣硬化及抑制炎癥中的具體機制尚不清楚。因此，本研究以高脂飲食聯合鏈脲佐菌素(STZ)誘導糖尿病動脈粥樣硬化大鼠模型為研究對象，觀察利拉魯肽對動脈粥樣硬化大鼠miR-155水平及TLR4/NF-κB表達的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 利拉魯肽(諾和諾德中國制藥有限公司)，SD大鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司)，高脂飼料(北京科澳協力飼料有限公司)，STZ(美國Sigma公司)，qPCR引物購自北京擎科公司，血糖儀和試紙(德國拜耳)，El-800全自動生化分析儀(PE公司，USA)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物:8周齡雄性SD大鼠40只，體重200～220g，適應性喂養1周后隨機分為對照組(NC,n=10)給予普通飲食和高脂飲食組(HFD,n=30)給予高脂飲食。高脂飼料配比：55.7%的普通飼料，12%豬油，20%蔗糖，10%蛋黃粉，2%膽固醇，0.3%膽酸鹽。6周后，HFD組一次性腹腔注射STZ(30mg/kg)，給藥后第3天和第7天分別測內眥血血糖，均>16.7mmol/L認為2型糖尿病動脈粥樣硬化模型成功。模型大鼠隨機分為糖尿病組(DM)、利拉魯肽中劑量組[M-Lir, 200μg/(kg·d)，皮下注射]和利拉魯肽大劑量組[H-Lir, 400μg/(kg·d)，皮下注射][2-3]，每組10只，對照組和糖尿病組給予等量檸檬酸緩沖液，干預8周。

1.2.2 取血和主動脈組織：用3%戊巴比妥鈉麻醉，采集心臟血液用于測定TC、TG、LDL-C和 FBG。取主動脈根部病變組織，切成2mm長的血管環備用。

1.2.3 qRT-PCT檢測：(1)組織總RNA的提取：取-80℃冰箱中保存的新鮮冰凍組織，重量約為100mg，Trizol法提取總 RNA(按說明書操作)，用微量分光光度計測定OD260、OD280以及OD260/OD280值，計算RNA的純度和濃度。(2)檢測目的基因表達水平：逆轉錄反應體系(其中miR-155采用莖環法)，RNA 5μg,Oligo(dT)2μl,dNTP 4μl,5×buffer 4μl,逆轉錄酶1μl,RNase inhibitor 0.5μl,加DEPC水補至20μl,(其中miR-155引物為Loop primer),25℃ 5min，50℃ 15min，85℃ 5min，4℃ 10min，產物 cDNA保存于-20℃。(3)熒光定量PCR反應體系(cDNA 稀釋5倍),SYBR Green Master Mix 10μl,上游引物0.4μl，下游引物0.4μl，cDNA 4μl，ROX 0.4μl，DEPC水4.8μl,50℃ 2min，95℃ 10min；95℃ 30sec，60℃ 30sec，×40個循環。(4)QPCR產物的相對定量分析 ：采用2-△△Ct法進行數據的相對定量分析。

2 結果

2.1 利拉魯肽對糖尿病大鼠生化指標的影響 糖尿病組大鼠FBG、TC、TG、LDL-C水平均高于對照組(P<0.01)；體重明顯下降(P<0.01)；利拉魯肽中、大劑量干預組，FBG、TC、TG、LDL-C水平均低于糖尿病組(P<0.05)，體重未再繼續下降，而略有增加，與利拉魯肽干預后血糖下降及“三多一少”癥狀改善有關，見表1。

表1 利拉魯肽干預8周對糖尿病動脈粥樣硬化大鼠生化指標的影響

2.2 利拉魯肽對糖尿病大鼠動脈粥樣硬化病變部位炎癥基因表達的影響 與對照組相比，糖尿病組大鼠主動脈粥樣硬化部位miR-155、TLR4和NF-κB mRNA表達顯著升高(P<0.01)；與糖尿病組相比，利拉魯肽中、大劑量組miR-155和TLR4、NF-κB mRNA水平顯著下降(P<0.05)，且利拉魯肽大劑量組三者降低更顯著，尤其是對TLR4和NF-κB mRNA減低更明顯(P<0.01)，見表2。

表2 利拉魯肽對糖尿病大鼠動脈粥樣硬化組織miR-155、TLR4和NF-κBmRNA表達的影響

3 討論

動脈粥樣硬化是血管系統的慢性炎癥性疾病, 由血管壁多種細胞與多種炎癥因子相互作用的結果。越來越多的研究顯示，TLR4/NF-κB炎癥通路在人動脈粥樣硬化斑塊中高度活躍，密切參與動脈粥樣硬化的發生、發展[4]。近年研究顯示，miR-155作為新型炎性調節因子，與TLR4/NF-κB通路的關系錯綜復雜。首先，TLR4激活后通過髓樣分化因子88(MyD88)/TRIF信號通路促進NF-κB活化，NF-κB與miR-155HG啟動子結合，增加成熟miR-155表達，反過來miR-155又通過負反饋抑制MyD88、IKKs的表達，增強NF-κB活性，激發炎性瀑布反應，進而損傷血管內皮細胞，導致動脈粥樣硬化形成[5]。Kovacs等研究顯示，糖尿病大鼠視網膜細胞miR-155、miR-146表達增加，促進NF-κB活性，介導促炎因子釋放，從而導致血管炎癥發生[6]。另一研究也顯示，miR-155促進NF-κB通路大量激活，影響腫瘤壞死因子-α、白介素-6等炎癥因子釋放，增加巨噬細胞攝取氧化型低密度脂蛋白，導致泡沫細胞形成[7]。本研究顯示：糖尿病大鼠主動脈粥樣硬化病變組織miR-155水平升高，TLR4和NF-κB mRNA表達也呈一致性增加。提示高血糖誘導miR-155表達，促進TLR4/NF-κB炎癥通路激活，調節炎性因子和趨化因子分泌，進而介導血管內皮功能障礙，參與動脈粥樣硬化形成。因此，下調miR-155水平可能與動脈粥樣硬化改善和心血管事件低發生率相關。Kishore等研究顯示，骨髓干細胞移植通過旁分泌肝細胞生長因子，可以下調miR-155表達，從而改善心臟纖維化和心功能[8]。國內也有研究顯示，下調miRNA-155表達水平可顯著減少糖尿病腦缺血大鼠腦梗死體積[9]。

近年來，新型降糖藥物利拉魯肽除降血糖外，在改善血管內皮功能障礙、抗動脈粥樣硬化中的作用受到廣泛關注，但其具體作用機制尚不清楚。國外有研究顯示，利拉魯肽通過抑制單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、TNF-α和IL-1β的分泌，發揮抗炎作用，減輕主動脈粥樣硬化病變程度[10]。另一項實驗使用不同濃度利拉魯肽干預oxLDL誘導的泡沫細胞結果顯示，利拉魯肽處理的泡沫細胞TG和TC含量顯著降低，泡沫細胞胞漿脂質滴明顯減少，此外，利拉魯肽治療后泡沫細胞表現出氧化應激受損[11]。一項臨床研究顯示，對2型糖尿病合并肥胖的患者在二甲雙胍(1～2g/d)和磺脲類藥物(格列美脲)治療基礎上給予利拉魯肽1.2mg/d，6周后檢測到單個核細胞中TNF-α、IκB和TLR4 mRNA表達較對照組下降，沉默信息調節因子-1(SIRT1)基因表達增加，抑制NF-κB促炎效應，從而改善代謝狀況[12]。本研究顯示，利拉魯肽中劑量干預組miR-155水平下調，TLR4和NF-κB mRNA表達均減低，在利拉魯肽大劑量組對三者的降低更為顯著，提示利拉魯肽可呈劑量依賴性改善糖尿病動脈粥樣硬化大鼠，下調miR-155表達，抑制TLR4/NF-κB炎癥通路，進而減低下游炎癥因子的表達，發揮血管保護作用，成為糖尿病動脈粥樣硬化疾病新的治療靶點。另有研究也顯示，利拉魯肽可呈劑量依賴性抑制胰島素抵抗大鼠腎臟NF-κB、TNF-α和IL-6的表達,利拉魯肽大劑量組[200μg/(kg·d)]比低劑量組[100μg /(κg·d)]降低更明顯，可能參與腎功能改善[13]。

綜上所述，給予糖尿病動脈粥樣硬化大鼠補充利拉魯肽，不僅降低了血糖、血脂，還降低了動脈粥樣硬化組織miR-155水平及TLR4/NF-κB炎癥通路的表達，呈現劑量依賴性的抗炎作用，從而發揮血管保護，但其具體機制尚需進一步研究。