脊髓背角NMDA受體NR2B亞基對舒芬太尼耐受形成的研究*

李智宇

黃河科技學院附屬醫院麻醉科，河南省鄭州市 450000

舒芬太尼是一種強效的鎮痛藥，屬于阿片類的鎮痛藥，是臨床常用的一種麻醉藥物[1]。舒芬太尼在阿片類藥物中鎮痛效應最強，盡管該藥在臨床上使用是安全的，但長期使用此類藥物后，機體會對其產生耐藥性，而為了減少疼痛，不得不加大用藥劑量以達到與長期使用前類似的治療效果，從而影響患者的疼痛控制及生活質量。近年來有研究表明，N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體在中樞神經系統敏化及痛覺信號傳導等過程中具有重要作用，可預防急性阿片類藥物耐受的發生[2-3]。NMDA受體是離子型谷氨酸受體的一個亞型，在細胞增殖凋亡、信號傳導及神經性疾病(如精神性疼痛)等機制中起重要作用。NMDA受體是由基本亞基(NR1)和調節亞基(NR2)組成的異四聚體或異五聚體[4]。而NMDA受體2B(NMDA receptor2B，NR2B)亞基是NR參與疼痛調節的主要亞基。有研究表明，NR2B過度表達在神經病理性疼痛的產生和維持方面起關鍵作用[5]。因此，本研究主要通過建立舒芬太尼耐受SD大鼠模型，分析脊髓背角NR2B亞基表達水平情況，研究舒芬太尼耐受形成的作用。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 選取40只SD成年雄性大鼠，SPF級(清潔動物)，大鼠體重為180～200g，均由湖南中醫藥大學動物實驗中心提供。每只分籠圈養于動物中心實驗室。飼養溫度20～25℃，濕度50%～70%。適應性喂養1周后隨機分為研究組與對照組，每組20只。

1.2 兩組SD大鼠模型構建 對照組給予皮下注射0.9%氯化鈉溶液(生產廠家：國藥集團容生制藥有限公司，規格：10ml×0.9g×5支，國藥準字：H20044024)。2次/d，分別于8:00AM及20:00PM進行，共注射10d。研究組給予皮下注射舒芬太尼(生產廠家：宜昌人福藥業有限公司，規格：5ml∶250μg×5支，國藥準字：H20054256)建立舒芬太尼耐受SD大鼠模型。2次/d，分別于8:00AM及20:00PM進行，注射劑量為80μg/kg，共注射10d。

1.3 機械性刺激痛閾 分別于皮下注射前及皮下注射后第5天及第10天測量每只SD大鼠的機械性刺激痛閾。實驗前將SD大鼠置于有機玻璃箱內，適應環境15min，使用弗雷纖維絲(VonFrey纖維)刺激SD大鼠后肢足底至SD大鼠后爪出現縮足反應為止，力量由輕至重，每只連續測量3次，每次持續3s，測量時間間隔10min，取其平均值記錄作為每只SD大鼠的機械性刺激痛閾值。

1.4 熱縮足反應潛伏期 分別于皮下注射前及皮下注射后第5天及第10天測量每只SD大鼠的熱縮足反應潛伏期。實驗前將SD大鼠置于輻射熱測痛儀玻璃箱內，適應環境15min，調節光源與玻璃箱距離，觀察SD大鼠的縮足反應，每只連續測量3次，每次持續20s，測量時間間隔5min，取其平均值記錄作為每只SD大鼠的熱縮足反應潛伏期值。

1.5 脊髓背角NR2B亞基水平 兩組SD大鼠分別于皮下注射后第5天及第10天經上述檢測后各取10只SD大鼠處死，取SD大鼠左側脊髓背角(L4～L5)組織后提取總蛋白，將40μg蛋白加入樣本中水煮，使其變性，完成后將其加入十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠中電泳，將其轉膜至醋酸纖維素膜封閉2h。將NR2B和β-actin兔抗鼠多克隆抗體置于4℃環境下孵育，二抗常溫孵育60min，利用化學發光試劑。與昏暗光線下曝光膠片，將其浸泡于顯影液和定影液中。掃描條帶吸光度，并對比蛋白相對含量。

1.6 脊髓背角NR2B mRNA水平 兩組SD大鼠分別于皮下注射后第5天及第10天經上述檢測后各取10只SD大鼠處死，取SD大鼠左側脊髓背角(L4～L5)組織后提取總RNA，并逆轉錄成互補的cDNA模板擴增。NR2B mRNA基因引物：上游5’-TGGACAATTACYCCYCGACG-3’,下游5’-TCCGATTCTTCTTCTGAGCC-3’；β-actin基因引物：上游5’-ACTGCCGCATCCTCTTCCTC-3’，下游5’-ACTCCTGCTTGCTGATCCACAT-3’。條件設置：95℃5min，94℃30s，50～60℃退火30s，72℃40s，35個循環。完成后將其置入瓊脂糖凝膠中電泳，掃描條帶吸光度，并對比 mRNA相對含量。

2 結果

2.1 兩組SD大鼠注射前后機械性刺激痛閾值對比 對照組注射前后機械性刺激痛閾值比較差異無統計學意義(P>0.05)；注射后第5天和第10天研究組機械性刺激痛閾值高于對照組(P<0.05)；研究組注射后第5天和第10天機械性刺激痛閾值均高于注射前，且注射后第5天高于注射后第10天(P<0.05)。見表1。

2.2 兩組SD大鼠注射前后熱縮足反應潛伏期值對比 對照組注射前后熱縮足反應潛伏期值比較差異無統計學意義(P>0.05)；注射后第5天和第10天研究組熱縮足反應潛伏期值高于對照組(P<0.05)；研究組注射后第5天和第10天熱縮足反應潛伏期值均高于注射前，且注射后第5天高于注射后第10天(P<0.05)。見表2。

表2 兩組SD大鼠注射前后熱縮足反應潛伏期值比較

2.3 兩組SD大鼠脊髓背角NR2B 亞基及mRNA水平對比 研究組注射后第5天和第10天脊髓背角NR2B 亞基及mRNA水平均高于對照組，且研究組注射后第5天脊髓背角NR2B 亞基及mRNA水平均低于注射后第10天(P<0.05)；而對照組注射后第5天和第10天脊髓背角NR2B 亞基及mRNA水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 兩組SD大鼠脊髓背角NR2B亞基及mRNA水平比較

3 討論

舒芬太尼是芬太尼的衍生物，主要作用于μ阿片受體，阿片類物質與阿片受體結合能有效改善患者疼痛[6]。有研究表示，在臨床醫療及外科手術中，阿片類藥物對抑制患者急慢性疼痛具有重要意義[7]。雖然舒芬太尼在緩解疼痛方面效果顯著，無“天花板效應”，可持續增加劑量直至無痛，能讓患者“忘記疼痛”，但同時也會產生耐藥，降低鎮痛作用。近年來諸多學者致力于研究阿片類藥物的耐受機制，但有關舒芬太尼耐受研究較小。有學者發現，NMDA受體拮抗劑在抑制阿片類藥物耐受的方面效果顯著[8]。NR2B亞基是脊髓背角NMDA受體的重要組成部分，其結構和功能特征決定了NR2B參與神經病理性疼痛的發生、發展的病理過程[9]。因此，解析脊髓背角NMDA受體NR2B亞基對舒芬太尼耐受形成的作用，對臨床減少或避免舒芬太尼耐受，提高鎮痛效果十分重要。

目前臨床認為，藥物耐受的基礎是機體長期使用或解除依賴性藥物產生的代償性適應[10]。而多數依賴性藥物都能改變NMDA受體的表達和功能。NR2B亞基作為NMDA受體的重要亞基之一，在藥物誘導精神依賴過程中起重要作用[11]。有研究結果發現，NMDA受體激活后可促進NO的合成，導致SD大鼠機械性刺激痛閾值降低[12]。本研究中，在研究組SD大鼠對舒芬太尼產生鎮痛作用和痛覺過敏后持續給予舒芬太尼，其機械性刺激痛閾值較對照組顯著增高，說明舒芬太尼對SD大鼠產生了鎮痛作用，且隨著連續皮下注射舒芬太尼的次數增加，SD大鼠對舒芬太尼產生了耐藥，與既往多數研究結果一致，提示NR2B亞基與舒芬太尼耐受形成密切相關。本研究通過檢測發現注射后第5天和第10天SD大鼠脊髓背角NR2B 亞基及mRNA水平升高，提示NR2B亞基表達水平與舒芬太尼耐受密切相關，說明舒芬太尼誘導大鼠耐受形成主要是通過促進脊髓背角NR2B 亞基表達水平增加，進而產生痛覺過敏。本次研究未探討如何緩解舒芬太尼耐受形成，但既往有研究表示，可將NR2B亞基作為舒芬太尼耐受形成的治療靶點，為臨床改善急慢性疼痛提供方向[13]。

綜上所述，舒芬太尼耐受形成與脊髓背角NMDA受體NR2B亞基表達水平升高有關，可將NR2B亞基作為舒芬太尼耐受形成的治療靶點，為臨床改善急慢性疼痛提供方向。