MTHFRC677T基因多態(tài)性、葉酸及同型半胱氨酸水平與原發(fā)性肝細胞癌相關(guān)性分析*

孟凌云 陳 靜 山東省泰安市中心醫(yī)院檢驗科 7000； 山東第一醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院

原發(fā)性肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)為全球高發(fā)惡性腫瘤，位于致死性疾病前列[1]。與其相關(guān)的研究一直是醫(yī)學研究的熱點，肝臟是機體主要的代謝場所，其產(chǎn)生的亞甲基四氫葉酸還原酶(Methylene tetraphydrofolate reductase，MTHFR)是葉酸代謝的關(guān)鍵酶，不可逆的催化5,10-亞甲基四氫葉酸(5,10-MTHF)還原為5-甲基四氫葉酸(5-MTHF)，后者可以進一步進入甲基循環(huán)通路，通過同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)的重新甲基化過程間接為DNA甲基化和蛋白質(zhì)甲基化提供甲基，并且使血液中的同型半胱氨酸維持在一個較低的水平。并且已有研究證實HCY水平與基因多態(tài)性是具有相關(guān)性的[2]。在與其相關(guān)的眾多基因中，MTHFR C677T的突變是最常見的，會使得亞甲基四氫葉酸還原酶活性降低，進而導致Hcy升高[3]。雖然之前有對HCC患者的葉酸、Hcy水平的相關(guān)研究，但是并沒有明確說明其與基因突變之間的關(guān)系，并且有研究發(fā)現(xiàn)MTHFR基因多態(tài)性與HCC的相關(guān)性不盡相同[4-5]，推測其會受到地域、民族等因素的影響。為了進一步明確葉酸、Hcy及MTHFR C677T基因多態(tài)性與HCC患者的相關(guān)性，本文對HCC患者與上述三者的相關(guān)性進行研究，旨在為臨床診斷及預防HCC提供理論性指導。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2019年10月—2020年10月于泰安市中心醫(yī)院新診斷為原發(fā)性肝細胞癌(病理診斷明確)的患者(未行化療、放療及其他藥物治療)85例為HCC組，選取同一時期該醫(yī)院查體中心的健康人員85例為健康對照組。采樣前均告知患者家屬檢查方法及流程，并征得同意簽署知情同意書，同時此項研究已取得醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 血清葉酸及Hcy水平檢測：兩組受試者均于清晨空腹采取肘靜脈血樣，經(jīng)高速離心后取血清保存，以備后續(xù)檢測葉酸及Hcy水平并進行基因組DNA的提取。血清葉酸采用德國羅氏601系列全自動免疫發(fā)光分析儀；Hcy檢測采用德國羅氏8000全自動生化分析儀。所有試劑為進口配套試劑，質(zhì)控合格后進行檢測。

1.2.2 MTHFR C677T基因多態(tài)性檢測：收集受試者的外周血，提取樣本中DNA。采用 Taqman-MGB 方法測定各基因位點的SNP分型，相關(guān)儀器和試劑均購買自美國AB公司。對MTHFR C667T位點進行熒光定量PCR檢測。每個PCR反應(yīng)體系共計為10μl，其中加入3.5μl去離子水，1μl濃度為20ng/μl的DNA模板，0.5μl 的20×Taqman-MGB探針，5μl 的2×Taqman Universal Master Mix。反應(yīng)條件:95℃預變性10min，92℃變性15s，60℃延伸1min，20個循環(huán)；89℃變性15s，60℃延伸90s，30個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，把各反應(yīng)孔放置于VIIA7DX 型高通量熒光定量 PCR 儀上，分別讀取各反應(yīng)孔的終點熒光，然后利用分析軟件檢測位點中的基因分型。

2 結(jié)果

2.1 兩組葉酸及Hcy水平比較 HCC組葉酸水平低于健康對照組，Hcy水平顯著高于健康對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 兩組血清葉酸及Hcy水平比較

2.2 兩組MTHFR C677T基因多態(tài)性及等位基因頻率比較 HCC組TT型分布率顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；HCC組T基因頻率升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 兩組MTHFRC677T基因多態(tài)性及等位基因頻率比較(n)

2.3 MTHFR C677T不同基因型葉酸及Hcy水平比較 TT型Hcy水平明顯高于CT及CC型，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而三種基因型間葉酸水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 不同基因型葉酸及Hcy水平比較

3 討論

原發(fā)性肝細胞癌的發(fā)病率和死亡率居于癌癥前列，并且我國的原發(fā)性肝細胞癌患者占全球總數(shù)的一半以上[6]，近年來有很多有關(guān)其致病因素的研究，主要集中在生活環(huán)境、飲食習慣及病毒感染等方面[7]，而最新的研究顯示葉酸水平的降低與肝癌發(fā)生進展相關(guān)[8].葉酸的代謝是一個復雜的過程，已經(jīng)有研究證實其與基因MTHFR C677T的多態(tài)性是相關(guān)的[9]，而且其代謝過程會影響HCY的水平[10]。但是并沒有研究探討過其與原發(fā)性肝細胞癌的直接相關(guān)性。

國人由于喜食熟食及吸煙飲酒等不良習慣原因，容易導致缺乏葉酸、維生素B6和B12[11]，而葉酸水平降低則會導致體內(nèi)同型半胱氨酸的蓄積。Hcy是體內(nèi)蛋氨酸(SAM)循環(huán)的中間產(chǎn)物，而SAM是甲基重要供體，影響DNA甲基化和修復。Hcy蓄積，影響DNA的穩(wěn)定性，異常甲基化，造成基因序列的改變，包括原癌基因激活或者抑癌基因的失活，增加惡性腫瘤的患病風險[12]。本研究結(jié)果顯示，HCC組葉酸水平明顯低于健康對照組，而Hcy水平高于健康對照組，差異具有統(tǒng)計學意義，與既往研究結(jié)果一致。說明對于原發(fā)性肝細胞癌患者來說，重視葉酸攝入水平，對于肝癌的預防至關(guān)重要，同時，Hcy水平的升高作為患者罹患肝癌的重要指標，應(yīng)值得重視。本次研究中，MTHFR C677T基因在HCC組中TT型分布率顯著升高，T基因頻率升高，MTHFR基因的C677T位點突變最為常見，會降低亞甲基四氫葉酸還原酶的活性和熱穩(wěn)定性，繼而影響體內(nèi)葉酸代謝，使 Hcy甲基化過程受阻導致同型半胱氨酸在血漿中水平升高。該酶最常見的基因突變位點是rs1801133的C到T的突變，即TT突變型較CC野生型使得酶的活性顯著下降，引起葉酸合成減少，而葉酸的缺乏導致基因不穩(wěn)定性增加和甲基化障礙，與腫瘤的發(fā)生有相關(guān)性。另外，本研究對MTHFR C677T的不同基因型的葉酸及Hcy水平進行了具體研究，通過與其他基因型比較發(fā)現(xiàn)，TT型的Hcy水平顯著升高，然而不同基因型間葉酸水平比較差異無統(tǒng)計學意義，這與原永明等人[13]的研究結(jié)論相似。既然原發(fā)性肝細胞癌患者的MTHFR基因型及葉酸和Hcy水平會存在異常，那么檢測具有原發(fā)性肝細胞癌傾向人群的MTHFR基因型及葉酸和Hcy水平，對于及早預防肝癌是有幫助的。目前肝癌的治療方式，不僅局限于肝臟移植，靶向治療[14]及基因治療[15]也成為HCC治療的新方向。該研究通過基因型的檢測只能間接地反映酶的相對活性，并沒有對實際的酶活性進行測定，因此通過分析該酶血清含量及基因型反映的相對酶活性與 HCY 水平的關(guān)聯(lián)性，解釋該酶與 HCY 水平的關(guān)系可能存在一定的局限性。

綜上所述，原發(fā)性肝細胞癌傾向人群做MTHFR基因型及葉酸和Hcy水平檢測，對于及早預防肝癌有一定的幫助。但本研究屬于醫(yī)院內(nèi)病例對照研究，樣本偏少，可能存在選擇偏倚的情況，因此后續(xù)還需要進行較大規(guī)模的普查研究，以進一步證實研究結(jié)論及進行更深入的探討。