獨活凝膠貼膏穴位貼敷治療類風濕關節炎模型家兔的藥動學與藥效學研究*

王 銳，楊若依，卓雪群，王金銳，于春峰，楊 婧

（黑龍江中醫藥大學藥學院，黑龍江 哈爾濱 150040）

類風濕關節炎（RA）為慢性自身免疫性疾?。?-2］，若不及時治療，患者將承受巨大痛苦［3-4］。目前尚無治療RA的特效藥物，臨床主要以非甾體抗炎藥、糖皮質激素和免疫抑制劑為主，但易產生胃腸道刺激等不良反應［5-7］。穴位貼敷療法是將藥物貼敷在腧穴上，產生刺激作用，可避免肝首過效應，減少不良反應，提高患處的局部藥物濃度，適合長期用藥［8-9］。中藥獨活味苦、辛，性微溫，主要用于治療風寒濕痹、腰腳酸痛、感冒風寒夾濕、頭痛牙痛等癥［10］。蛇床子素和二氫歐山芹醇當歸酸酯在獨活中含量最高［11］。藥物代謝動力學（PK）-藥物效應動力學（PD）模型是將PK和PD過程整合為一體進行綜合評價，可使藥量與效應之間得到相互轉化［12］。微透析技術（MD）是一種可在體內進行連續取樣的生物學采樣技術，可在線實時檢測，在PK-PD模型研究中極具優勢且已被廣泛使用［13］。因此，本研究中將獨活凝膠貼膏通過穴位貼敷法對RA模型家兔進行給藥，建立了測定獨活主要成分蛇床子素和二氫歐山芹醇當歸酸酯含量的超高效液相色譜-串聯質譜（UPLCMS/MS）法，獲得病理狀態下獨活的PK參數，并以家兔血清中白細胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的含量變化為PD指標，建立PK-PD模型，分析獨活藥物主要成分在RA模型家兔體內的動態變化規律，進而探討獨活凝膠貼膏穴位貼敷給藥的作用機制。現報道如下。

1 儀器、試藥與動物

1.1 儀器

AB265-S型電子分析天平（拓赫機電科技上海有限公司，精度為萬分之一）；LC-20AT型高效液相色譜（HPLC）儀，Waters UPLC-TQD型質譜儀（沃特世科技＜上海＞有限公司）；VM-300型渦旋振蕩器（南京稼竣生物科技有限公司）；CMA 20型關節微透析探針，CMA 402型雙通道微量注射泵，CMA 470型冷卻微量自動收集器，均購于瑞典CMA公司；RH-30型恒溫箱（東莞市泓進檢測儀器有限公司）。

1.2 試藥

獨活飲片（哈爾濱市潤禾中藥飲片加工廠，批號為20190410）；卵清蛋白（批號為20190304），無水乙醇（批號為20190227），生理鹽水灌流液（批號為20190318），聚丙烯酸鈉NP700（批號為20181221），氮酮（批號為20181115），酒石酸（批號為20181228），均購于山西錦洋藥用輔料有限公司；弗氏完全佐劑（FCA，美國Sigma公司，批號為20190108）；聚乙烯吡咯烷酮（PVP）K90（天津博迪化工股份有限公司，批號為20190210）；丙三醇（天津市富宇精細化工有限公司，批號為20190105）；肝素鈉（批號為20190311），脫毛膏（批號為20180524），水合氯醛（批號為20190113），均購于漢唐生物公司；蛇床子素標準品（批號為wkq190020104，純度≥98.556%），二氫歐山芹醇當歸酸酯標準品（批號為wkq18042305，純度≥98.447%），均購于四川維克奇生物科技有限公司；IL-1β酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（批號為20190318），TNF-αELISA試劑盒（批號為20190314），均購于武漢云克隆科技股份有限公司；無水乙腈、甲醇為色譜純，氯仿為分析純。

1.3 動物

新西蘭雌性家兔10只，體質量（2.0±0.5）kg，購于黑龍江中醫藥大學實驗動物中心，動物生產許可證號為SCXK（黑）2019-0510。飼養于室內通風良好，溫度為22～25℃，相對濕度為45%～60%，在明暗交替（12h/12h）的環境中適應性飼養7 d，實驗前12～24 h禁食不禁飲。

2 方法與結果

2.1 蛇床子素和二氫歐山芹醇當歸酸酯含量測定

2.1.1 色譜條件與質譜條件

色譜條件：色譜柱為Acquityuplc?hsst3柱（75 mm×2.1 mm，1.8μm）；流動相為乙腈-甲醇溶液（48∶52，V/V）；流速為0.2 mL/min；柱溫為30℃；進樣量為5μL。

質譜條件：離子源為電噴霧離子源（ESI），離子化模式為正離子檢測（+）；毛細管電壓為2.8 kV，錐孔電壓為65 V；去溶劑氣溫度為350℃；氮氣流速為0.3 m/s；碰撞能量為40 V；定量分析的離子對包括蛇床子素質荷比（m/z）245→189，二氫歐山芹醇當歸酸酯母離子m/z329→229。

2.1.2 溶液制備

取蛇床子素標準品2.7 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加入生理鹽水溶解并定容，即得質量濃度為27μg/mL的蛇床子素對照品溶液。另取二氫歐山芹醇當歸酸酯標準品0.9 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加入生理鹽水溶解并定容，即得質量濃度為9μg/mL的二氫歐山芹醇當歸酸酯對照品溶液。精密量取微透析樣品50μL，置2 mL離心管中，加入氯仿溶液100μL，渦旋1 min，以4 000 r/min的速率離心10 min，靜置2 min，精密吸取下層溶液120μL，于通風櫥中蒸干氯仿，剩余固體殘渣用50μL甲醇復溶，渦旋3 min，即得供試品溶液。

2.1.3 方法學考察

專屬性試驗：吸取2.1.2項下對照品溶液、供試品溶液及空白微透析樣品溶液，按2.1.1項下色譜與質譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果蛇床子素、二氫歐山芹在其出峰位置處無雜質峰干擾。色譜圖見圖1。

圖1 超高效液相色譜-串聯質譜圖Fig.1 UPLC-MS/MS chromatograms

線性關系考察：分別吸取2.1.2項下蛇床子素對照品溶液和二氫歐山芹醇當歸酸酯對照品溶液適量，分別加入生理鹽水，制成蛇床子素質量濃度分別為1.08，2.70，5.40，16.20，32.40，54.00，160.96，270.00 ng/mL和二氫歐山芹醇當歸酸酯質量濃度分別為0.36，0.90，1.80，5.40，10.80，180.00，53.65，90.00 ng/mL的系列對照品溶液，經0.22μm微孔濾膜濾過，取續濾液，按2.1.1項下色譜與質譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質量濃度（X，ng/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，蛇床子素和二氫歐山芹醇當歸酸酯的回歸方程分別為Y蛇=568.64X蛇+453.51（r=0.999 8，n=8），Y二=454.22X二+376.81（r=0.999 8，n=8）。結果表明，蛇床子素和二氫歐山芹醇當歸酸酯的質量濃度分別在1.08～270.00 ng/mL和0.36～90.00 ng/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度與準確度試驗：分別吸取2.1.2項下蛇床子素和二氫歐山芹醇當歸酸酯對照品溶液適量，加入生理鹽水，制成蛇床子素和二氫歐山芹醇當歸酸酯低、中、高質量濃度分別為1.08，32.40，160.96 ng/mL和0.36，10.80，53.65 ng/mL的待測溶液，按2.1.1項下色譜與質譜條件進樣測定，記錄峰面積。同日內連續測定6次，考察日內精密度；每日測定1次，連續測定3 d，考察日間精密度；以實測質量濃度與理論質量濃度的百分比考察準確度。結果蛇床子和二氫歐山芹醇當歸酸酯日內、日間精密度的RSD均小于5.00%，準確度均大于99.00%，表明儀器的精密度與準確度均良好。

穩定性試驗：吸取精密度與準確度試驗項下蛇床子和二氫歐山芹醇當歸酸酯低、中、高質量濃度分別為1.08，32.40，160.96 ng/mL和0.36，10.80，53.65 ng/mL的待測溶液，分別在室溫下放置14 d，反復凍融（-20～20℃）6次后，按2.1.1項下色譜與質譜條件進樣測定6次，記錄峰面積。結果蛇床子素和二氫歐山芹醇當歸酸酯的RSD均小于10.00%（n=6），表明上述放置條件下供試品溶液穩定性良好。

2.2 PK-PD模型研究

2.2.1 獨活凝膠貼膏制備

取獨活飲片50 g，精密稱定，置1 000 mL圓底燒瓶中，加9倍量80%乙醇回流提取2次，每次提取2 h，以紗布過濾3次，取濾液，置旋轉蒸發儀中至無醇味且呈稠膏狀，置60℃真空干燥箱中干燥48 h，得獨活浸膏，總得率為85%。取甘油30 g，加入聚丙烯酸鈉NP700 5.5 g，攪拌均勻，加入獨活浸膏9 g、PVPK90-氮酮-酒石酸混合溶液0.75 g（取酒石酸0.2 g，加入溶脹的PVPK90 0.45 g，混勻，緩慢加入2%氮酮溶液中，即得），再加入2%氮酮0.06 g，充分混合，均勻涂于無紡布上，覆蓋聚乙烯薄膜，密封包裝，即得獨活凝膠貼膏。另制備不含獨活的空白凝膠貼膏。

2.2.2 造模［14］、分組與給藥

取10只家兔，隨機選取2只作為正常對照組，其余8只用于造模。取造模組家兔，用脫毛膏脫去雙后肢膝關節及背部肩胛骨處的毛，將1 mL乳劑（取卵蛋白100 mg，溶于5 mL生理鹽水中，制成卵蛋白生理鹽水溶液，再與5 mL弗氏完全佐劑混合制成乳劑）分5個點于家兔肩胛區皮下注射，第14天以相同方法加強致敏。第2次致敏后6 d，將1 mL卵原蛋白生理鹽水溶液注射于家兔雙側后膝關節腔內。正常對照組家兔予生理鹽水同法注射。當造模組家兔表現出精神萎靡、活動減少且緩慢、關節變形；表面皮膚溫度明顯升高，隨后逐漸恢復至穩定水平，但仍高于正常對照組；體質量隨時間推移而升高，但增長速率較健康狀態家兔的速率逐漸放緩；致敏當日飲食量下降，隨后逐漸恢復；致敏當日關節腫脹明顯，約為正常對照組的3倍，隨后逐漸恢復至正常對照組的2倍，即為造模成功。將造模成功的家兔隨機分為穴位給藥組［于足三里穴位給予獨活凝膠貼膏0.40 mg/g（按獨活生藥量計）］和模型組（空白凝膠貼膏，直接貼敷于造模家兔膝蓋正上方），各4只。注射卵原蛋白生理鹽水治療3 d后（此時家兔膝關節腫脹最嚴重），微透析探針植入膝關節中平衡1 h，貼敷藥物，連續取樣14 h。

2.2.3 PK參數分析

穴位給藥組家兔給藥后，采用微透析技術連續14 h收集關節腔液，按2.1.2項下方法處理，按2.1.1項下色譜與質譜條件進樣測定，記錄峰面積，代入線性關系考察項下回歸方程，計算各時間點家兔關節腔液中蛇床子和二氫歐山芹醇當歸酸酯的質量濃度。采用Win-Nonlin Examples Guide 5.2.1軟件計算赤池信息量準則（AIC）值和許瓦茲貝葉斯信息準則（SBC）值（見表1），擬合得PK參數（見表2），繪制藥物濃度-時間曲線圖（見圖2）。其中，k01為一級吸收速率常數，k10為一級消除速率常數，AUC0～14h為0～14 h的血藥濃度-時間曲線下面積，k01_HL為吸收相半衰期，k10_HL為消除相半衰期，tlag為保留滯后時間，tmax為達峰時間，Cmax為達峰濃度。

表1 穴位給藥組家兔房室模型AIC值和SBC值Tab.1 AIC and SBC values of rabbit compartment model in acupoint administration group

表2 穴位給藥組家兔蛇床子素和二氫歐山芹醇當歸酸酯的PK參數Tab.2 PK parameters of osthole and columbianadin in the acupoint administration group

圖2 穴位給藥組家兔關節腔液中藥物濃度-時間曲線Fig.2 Concentration-time curve of drug in the joint cavity fluid of rabbits in the acupoint administration group

AIC值和SBC值的數值越小，與某一模型的擬合度越好。由表1可知，穴位給藥組家兔一室模型的AIC值和SBC值均低于二室模型；由表2和圖2可知，穴位給藥1 h后關節腔液中可檢測到蛇床子素和二氫歐山芹醇當歸酸酯，說明穴位給藥初始吸收較緩慢，但2 h后關節腔液中藥物濃度迅速升高，蛇床子素和二氫歐山芹醇當歸酸酯藥物質量濃度分別于5.70 h和6.52 h時達到峰值，且保持平穩狀態并維持較長時間。表明穴位貼敷療法藥效持久且療效穩定。

2.2.4 PD參數分析

給藥后，各組家兔連續14 h通過耳緣靜脈采血，室溫下靜置10～20 min，以3 000 r/min的速率離心20 min，取上清液，于-20℃下冷凍保存。按ELISA試劑盒說明書方法操作，采用酶標儀于450 nm波長下測定家兔血清中IL-1β和TNF-α的細胞因子水平，抑制率（IR）作為效應值（E）進行計算。IR（%）=［（模型組細胞因子水平-給藥組細胞因子水平）/模型組細胞因子水平］×100%。

模型組家兔關節腔液中IL-1β和TNF-α的14 h平均抑制率分別為（-4.23±4.04）%和（-4.03±3.24）%，表明模型組14 h內抑制率無變化。將穴位給藥組與模型組家兔的IL-1β和TNF-α水平數據進行獨立樣本雙側t檢驗，結果兩組間比較差異顯著（P＜0.05），表明穴位給藥組可通過降低IL-1β和TNF-α水平以抑制RA炎癥。

2.3 關節腔局部PK-PD的模型擬合

應用WinNonlin Examples Cuide 5.2.1軟件對數據進行智能化分析，以AIC值和SBC值確定最佳房室模型，以穴位給藥組家關節腔液藥物濃度為PK指標，家兔血清中IL-1β和TNF-α抑制率為PD指標，構建PK-PD模型，擬合參數見表3。其中，Emax為最大效應值，ECe50為可預知達到1/2藥效所需的藥物濃度，keo為效應室藥物消除速率常數。結果顯示，穴位給藥途徑適用于簡單最大效應模型；繪制穴位給藥組家兔血清中免疫指標抑制百分數（EIR）與關節腔液中藥物濃度（C）的效應曲線圖，詳見圖3。

圖3 穴位給藥組家兔關節腔液中藥物濃度-效應曲線Fig.3 Concentration-effect curve of drug in the articular cavity fluid of rabbits in the acupoint administration group

表3 穴位給藥組家兔血清中IL-1β和TNF-α的PK-PD擬合參數Tab.3 PK-PD fitting parameters of serum IL-1βand TNF-α in the acupoint administration group

3 討論

RA是一種慢性自身免疫性疾病，臨床表現為關節腫脹、僵硬、畸形，嚴重影響患者的身心健康，其主要病理變化為人體關節滑膜的慢性炎癥，由關節滑膜細胞分泌多種細胞因子導致。研究發現，1L-1β和TNF-α均可導致關節滑膜組織炎癥，且有助于滑膜細胞增殖［15-17］。獨活治療RA療效顯著，本研究中建立了測定其指標性成分蛇床子素和二氫歐山芹醇當歸酸酯含量的UPLC-MS/MS法，方法操作簡便，結果準確，重復性好，可用于PK研究。

本研究中通過測定家兔關節腔透析液中的藥物質量濃度，建立了相應的PK模型。以血液中IL-1β和TNF-α的抑制率為PD端點，擬合了PK-PD模型，定量描述關節腔液中PK指標變化與PD之間的聯系。由圖3可知，14 h內藥物濃度與效應為非線性關系，呈現逆時針曲線趨勢，藥物效應在關節腔液藥物濃度下降期仍保持在較高的水平甚至出現了效應的峰值。即給藥后，關節腔液中的藥物質量濃度逐漸降低，藥效卻先升高再降低，說明穴位給藥后關節腔液中的藥物質量濃度與藥物效應可能不同時發生并存在滯后效應。但該方法驗證并不完全，也可能與穴位貼敷療法可以放大藥物療效有關。

綜上所述，RA病因及發病機制復雜，本研究中僅觀測連續給藥后家兔血清中IL-1β和TNF-α的動態變化規律，擬合PK-PD模型，研究還不夠全面，以后將研究如何直接、連續地確定體內藥物質量濃度和藥效，通過數學模型擬合藥物變化與疾病狀態間的關系和相關性，以進一步探討獨活治療RA的作用機制。