小建中湯治療抑郁癥作用機制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究*

賈 暖，趙佳鋒，錢萬橋，張柳燕，郭 順

（南方科技大學(xué)醫(yī)院，廣東 深圳 518055）

抑郁癥以顯著而持久的心境低落為主要臨床特征，是心境障礙的主要類型。嚴(yán)重困擾患者的生活，影響其正常的社會功能［1］。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，2015年全球抑郁癥患病人數(shù)已達(dá)3.22億，中國的抑郁癥患病率約為4.2%［2］；2019年，中國精神衛(wèi)生調(diào)查研究報告顯示，我國抑郁癥患者的終身患病率為6.8%，12個月患病率為3.6%［3］；2017年，世界衛(wèi)生組織有關(guān)全球疾病負(fù)擔(dān)的統(tǒng)計顯示，抑郁障礙的傷殘損失壽命年排第三位［4］。抑郁癥不僅損害患者的健康，而且給家庭和社會造成極大負(fù)擔(dān)。目前，西醫(yī)治療抑郁癥存在許多不足，中藥及其復(fù)方制劑治療效果好，副作用少，依從性高［5］。小建中湯和舒肝解郁膠囊治療焦慮癥的有效率分別為97%和90.9%［6］。小建中湯治療老年抑郁癥2周、4周后，緩解抑郁情緒的有效例數(shù)分別為7/12例、10/12例［7］。小建中湯是《傷寒論》經(jīng)方，由飴糖、桂枝、芍藥、甘草、大棗、生姜組方，為溫養(yǎng)中焦之劑，溫中補虛，和里緩急，主治中焦虛寒、肝脾不和證，但其治療郁證的研究相對較少［8］。2007年，英國鄧迪大學(xué)Hopkins教授在網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)的基礎(chǔ)上提出網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)［9］，通過構(gòu)建藥物-靶點-基因-疾病的相互作用網(wǎng)絡(luò)，運用專業(yè)的可視化網(wǎng)絡(luò)分析軟件及算法，對現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫信息進(jìn)行虛擬篩選和網(wǎng)絡(luò)預(yù)測，探討藥物的作用機制［10］。由于其復(fù)雜性、整體概念及中醫(yī)理論的辨證論治，中藥作用機制的研究較困難。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究理念恰好與中藥多組分、多靶點、協(xié)同調(diào)節(jié)的作用模式契合，具有整體性、系統(tǒng)性的特點［11］。本研究中采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討了小建中湯抗抑郁的作用機制。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 潛在活性成分及靶點篩選

通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫（http://tcmspw.com/index.php）得到飴糖、桂枝、芍藥、甘草、大棗、生姜的所有化合物成分，設(shè)定口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18、血腦屏障（BBB）≥-0.3為篩選條件，篩選出潛在的活性成分。再檢索PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov），得到活性成分的2D結(jié)構(gòu)，最后在Swiss TargetPrediction數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch）預(yù)測靶點，同時運用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建主要潛在活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.2 抑郁癥靶點獲取

通過檢索GeneCard數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）、OMIM數(shù)據(jù)庫（http://www.omim.org/）、DisGeNET數(shù)據(jù)庫（http://www.disgenet.org），得到與抑郁癥相關(guān)的所有靶點基因，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/），校對得到靶點基因名，選擇生物物種為homo sapiens（human）。選擇3個數(shù)據(jù)庫中2個數(shù)據(jù)庫及以上共有的靶點作為疾病候選靶點。

1.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建

將藥物的靶點蛋白和疾病候選靶點蛋白分別導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），物種設(shè)為“Homo sapiens”，閾值設(shè)為中等置信度“mediumconfidence=0.4”，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置不變，獲取2個蛋白相互作用的PPI。結(jié)果以.tsv格式保存，并導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件，通過“Merge”功能得到2個PPI的交集網(wǎng)絡(luò)，再利用“Network Analysis”功能分析網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩裕罁?jù)其節(jié)點度值的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，明確核心靶點蛋白。

1.4 GO富集分析和KEGG通路分析

使用Metascape在線分析工具（http://metascape.org）對網(wǎng)絡(luò)合并后獲得的核心靶點蛋白分別進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析。采用統(tǒng)計學(xué)超幾何分布定量（P）＜0.01評估存在于各GO注釋中的蛋白質(zhì)群，以P值反映蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的顯著性，選擇生物過程、分子功能、細(xì)胞組分3個模塊。通過KEGG通路分析的功能條目，考察中藥的潛在靶標(biāo)可能具有的生物學(xué)功能及參與的生物學(xué)通路，進(jìn)而得到小建中湯治療抑郁癥的主要作用通路。

2 結(jié)果

2.1 小建中湯潛在活性成分及靶點獲取

共得到90個潛在活性成分，桂枝3個，甘草69個，大棗18個，白芍3個，生姜5個，其中有4個成分是2個以上藥物的共有成分。TCMSP數(shù)據(jù)庫無法檢索到飴糖，由于飴糖在小建中湯中含量較高，結(jié)合TCMID數(shù)據(jù)庫（http://www.megabionet.org/tcmid/）和文獻(xiàn)［12-13］，保留其麥芽糖這一主要活性成分。去掉Swiss TargetPrediction數(shù)據(jù)庫預(yù)測到的靶點可能性小于0.1及無法預(yù)測到靶點的成分，增加肉桂醛、芍藥苷、牡丹酚、沒食子酸4個可能對抑郁癥有作用的成分［14-16］。最終得到68個成分，其中潛在活性成分桂枝4個，甘草51個，大棗9個，白芍6個，生姜5個，飴糖1個。在Swiss TargetPrediction數(shù)據(jù)庫中檢索潛在活性成分，獲得144個靶點，同時運用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建藥物-潛在活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，得到6個藥物，68個藥物成分，144個靶點基因。節(jié)點的度值越大，節(jié)點大小越大，顏色越深。詳見圖1。

圖1 藥物-藥物成分-靶點基因網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Herbs-active ingredient-target gene network

2.2 抑郁癥靶點獲取、PPI構(gòu)建及核心網(wǎng)絡(luò)提取

通過檢索GeneCard，OMIM，DisGeNET 3個數(shù)據(jù)庫，并經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫校對，得到2個及以上數(shù)據(jù)庫共有的疾病靶點，共1 844個疾病基因。藥物靶點基因與疾病靶點基因分別做PPI后，去掉游離節(jié)點，得到藥物靶點基因的PPI共132個節(jié)點，909條邊；疾病靶點基因的PPI共1 735個節(jié)點，45 251條邊。2個網(wǎng)絡(luò)交集得到67個節(jié)點、434條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)，通過設(shè)置度值＞12（度值的中位數(shù)），篩選得36個節(jié)點、280條邊的PPI，得到核心靶點基因36個。詳見圖2。其對應(yīng)的核心活性成分36個（見表1）。根據(jù)度值測算出小建中湯治療抑郁癥的前10個重要靶標(biāo)，分別為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、單胺氧化酶A（MAO-A）、單胺氧化酶B（MAO-B）、海馬神經(jīng)元中淀粉樣前體蛋白（APP）、乙酰膽堿酯酶（AChE），以 及CNR1，CHRNA4，SLC6A4，DRD2，SLC6A3。

表1 小建中湯治療抑郁癥的核心活性成分Tab.1 Core active ingredients of Xiaojianzhong Decoction in the treatment of depression

圖2 核心靶點基因網(wǎng)絡(luò)提取過程Fig.2 Extraction process of core target gene network

2.3 核心靶點基因GO富集分析及KEGG通路分析

使用Metascape在線分析工具對小建中湯治療抑郁癥的36個核心候選靶點進(jìn)行GO富集分析，生物過程共富集到630條，主要涉及化學(xué)突觸傳遞、G蛋白耦聯(lián)受體信號通路、與環(huán)狀核苷酸第二信使耦聯(lián)、神經(jīng)遞質(zhì)水平的調(diào)節(jié)、化學(xué)突觸傳遞的調(diào)節(jié)等，詳見圖3。分子功能共富集到61條，主要涉及G蛋白耦聯(lián)的胺受體活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、兒茶酚胺結(jié)合、腎上腺素受體活性、多巴胺結(jié)合、血清素受體活性等，詳見圖4。細(xì)胞組分共富集到46條，主要涉及突觸前膜、突觸后膜、樹突、膜筏等，詳見圖5。使用Metascape在線分析工具對小建中湯治療抑郁癥的36個核心候選靶點進(jìn)行KEGG生物途徑富集分析，共富集到31條。結(jié)果顯示，其機制主要涉及神經(jīng)活性配體-受體相互作用、血清素能突觸、多巴胺能突觸、環(huán)磷酸腺苷（cAMP）、可卡因成癮、間隙連接、調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞中的脂肪分解、苯丙胺成癮、環(huán)磷酸鳥苷酸（cGMP）-環(huán)磷酸鳥苷酸依賴的蛋白激酶（PKG）、內(nèi)分泌抵抗、雌激素信號通路、Rap1、膽堿能突觸、腎素分泌等信號通路，詳見圖6。

圖3 生物過程GO富集氣泡圖Fig.3 Bubble chart of GO enrichment for biological process

圖4 分子功能GO富集氣泡圖Fig.4 Bubble chart of GO enrichment for molecular function

圖5 細(xì)胞組分GO富集氣泡圖Fig.5 Bubble chart of GO enrichment for cell components

圖6 KEGG通路富集氣泡圖Fig.6 Bubble chart of KEGG pathway

2.4 小建中湯核心成分-核心靶點-通路構(gòu)建

使用Cytoscape 3.8.0軟件對前20條通路及其對應(yīng)靶點和化合物進(jìn)行分析，構(gòu)建小建中湯治療抑郁癥對應(yīng)核心成分-核心靶點-通路網(wǎng)絡(luò)示意圖，得到31個核心靶點，20條信號通路，31個核心成分。節(jié)點的度值越大，節(jié)點大小越大，顏色越深，詳見圖7。可見，荷葉堿（nuciferin）、可可堿［（S）-coclaurine］、左旋千金藤啶堿（stepholidine）等為小建中湯的有效成分，雌激素受體1（ESR1）及AKT1，AchE，MAO-B等為作用靶點，神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路（neuroactive ligand-receptor interaction）、5-羥色胺能突觸（serotonergic synapse）、鈣信號通路（calcium signaling pathway）等為信號通路。

圖7 核心成分-核心靶點-通路網(wǎng)絡(luò)Fig.7 Core ingredients-core targets-pathway network

3 討論

本研究中，通過預(yù)測靶點基因、構(gòu)建PPI及提取核心網(wǎng)絡(luò)，共篩選出AKT1，SLC6A4，APP，DRD2，MAO-A，CHRNA4，MAO-B，SLC6A3，AchE，CNR1等36個核心靶點。Akt1為磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）下游的關(guān)鍵靶點之一，重度抑郁癥自殺患者的腦組織中Akt蛋白活性明顯降低［17］。研究發(fā)現(xiàn)，Akt1的多態(tài)性與抑郁癥患者的抑郁嚴(yán)重程度顯著相關(guān)，與抑郁癥患者的焦慮癥狀、工作、活動、自殺傾向密切相關(guān)［18］。SLC6A3和SLC6A4分別為多巴胺和5-羥色胺（5-HT）的轉(zhuǎn)運蛋白，在調(diào)節(jié)對這些神經(jīng)遞質(zhì)的神經(jīng)元反應(yīng)中起重要作用［19］。研究發(fā)現(xiàn)，抗抑郁藥物通過停留在跨膜螺旋1，3，6，8，10間的中央結(jié)合位點而將SLC6A4鎖定為向外開放的構(gòu)型，直接阻斷5-HT的結(jié)合［20］。SLC6A3敲除小鼠的抑郁癥動物模型實驗結(jié)果顯示，多巴胺轉(zhuǎn)運蛋白的活性對抑郁癥有顯著影響［21］。APP的過度表達(dá)導(dǎo)致β-淀粉樣肽的產(chǎn)生增加，進(jìn)而抑制興奮性傳遞［22］。DRD2是多巴胺系統(tǒng)中的一個重要受體，是目前使用的多數(shù)抗精神病藥物的靶標(biāo)［23］。有研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦深部內(nèi)側(cè)前腦束刺激后表現(xiàn)出抗抑郁樣反應(yīng)，同時DRD2表達(dá)增加［24］。MAO-A和MAO-B與抑郁癥密切相關(guān)，在單胺類神經(jīng)遞質(zhì)代謝中起關(guān)鍵作用，均為抗抑郁藥物單胺氧化酶抑制劑的藥理學(xué)作用靶點［25-26］。已有研究證明，β-細(xì)辛醚可減少小鼠腦內(nèi)AChE的表達(dá)水平，且增加小鼠腦內(nèi)的多巴胺表達(dá)水平，進(jìn)而發(fā)揮抗抑郁作用［27］。CNR1與抑郁癥密切相關(guān)，其激動劑具有抗抑郁樣性質(zhì)，并通過前額葉內(nèi)側(cè)皮層調(diào)節(jié)5-HT的神經(jīng)元活性［28］。

KEGG通路富集分析結(jié)果表明，小建中湯治療抑郁癥主要的通路為神經(jīng)活性配體-受體相互作用、血清素能突觸、鈣信號通路、多巴胺能突觸、cGMP-PKG信號通路等。其中，神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號通路涉及細(xì)胞質(zhì)膜上所有與細(xì)胞內(nèi)外信號通路相關(guān)的受體和配體［29］。該通路涉及了血清素受體、多巴胺受體、腎上腺素受體等20個靶點。而該通路與抗精神病藥理學(xué)有關(guān)，這對于制訂改善精神分裂癥的治療策略至關(guān)重要［30］。研究表明，抑郁癥與5-HT受體及其功能有較大聯(lián)系，且5-HT1A，5-HT1B，5-HT1D，5-HT2A，5-HT2C，5-HT7等受體與抑郁癥關(guān)系密切［31］。快感缺乏癥被認(rèn)為是抑郁癥的核心特征，而多巴胺系統(tǒng)在這種抑郁癥所描述的欣快感缺失中起著關(guān)鍵作用［32］。研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥與二價鈣離子的失調(diào)有關(guān)，其主要通過鈣信號傳導(dǎo)級聯(lián)發(fā)揮作用［33］。鈣信號通路刺激一氧化氮（NO）合成，進(jìn)而誘導(dǎo)鳥苷酸環(huán)化酶將三磷酸鳥苷轉(zhuǎn)化為cGMP。另有研究表明，小檗堿通過NO-cGMPPKG細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮抗抑郁作用［34］。

綜上所述，小建中湯治療抑郁癥具有多靶點、多途徑、多通路的特點，多巴胺受體、轉(zhuǎn)運蛋白、AchE和MAO為小建中湯抗抑郁的主要候選靶點，其可能通過神經(jīng)活性配體-受體相互作用、血清素能突觸、多巴胺能突觸、鈣信號等通路發(fā)揮作用。