回春育子顆粒質量標準研究*

曹寶帥，薛剛強，頡維民，潘新艷

（1.河北省衡水市綜合檢驗檢測中心，河北 衡水 050024；2.河北省石家莊市第四醫院，河北 石家莊 050011；3.河北省人民醫院績效考核辦公室·質量管理控制辦公室，河北 石家莊 050051）

回春育子顆粒為石家莊市第四醫院的院內制劑，是由炙淫羊藿、枸杞子、熟地黃、當歸、甘草、骨碎補、川續斷等20余味中藥材制成的中藥復方顆粒，臨床用于治療腎精虧虛之精子活動力差、死精過多、精子數少等原因造成的不育癥［1］。基于中醫腎精虧虛型不育癥的辨證機理和西醫少弱精子癥發病機制的研究基礎，前期研究中對回春育子顆粒的組方和臨床療效進行研究，確定了具有代表性的中藥成分和化合物作為質量標志物［2-6］。方中淫羊藿溫補腎陽，熟地黃、五味子滋補腎陰，甘草祛濕熱、清邪毒，川續斷補肝腎、強筋骨，當歸補肝腎、益精血。甘草具有保護睪丸和抗生殖系統炎癥等作用［7-8］；續斷、燙狗脊、骨碎補藥理活性成分具有抗炎、調節免疫、抗菌、抗氧化等作用［9-11］。現代藥理學研究發現，回春育子顆粒組方中淫羊藿、五味子的藥理活性成分能促進體內相關遞質和激素的釋放，改善勃起功能，提高性欲，改善生精細胞功能，促進精子生成等［12-15］。目前，回春育子顆粒的質量控制僅采用薄層色譜（TLC）法對炙淫羊藿苷和枸杞子對照藥材進行定性鑒別。但本制劑由多味中藥材組方，多靶點作用于不育癥，僅做定性鑒別具有一定局限性［2］。因此，本研究中對回春育子顆粒組方所確定的質量標志物進行定性鑒別和定量分析，為提高回春育子顆粒的質量標準提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；XS205型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為十萬分之一）；KQ-300VDE型三頻數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為300 W，頻率為45/80/100 kHz）；全自動薄層色譜成像系統（上海科哲生化科技有限公司）；硅膠G薄層板，硅膠GF254薄層板，均購于青島海洋化工有限公司。

1.2 試藥

回春育子顆粒（醫院制劑，批號分別為20180320，20180522，20180807）；當歸對照藥材（批號為120927-201617），熟地黃對照藥材（批號為121196-201406），甘草對照藥材（批號為120904-201620），川續斷皂苷Ⅵ對照品（批號為111685-201707，純度為90.9%），原兒茶酸對照品（批號為110809-201205，純度為99.9%），阿魏酸對照品（批號為110773-201614，純度為99.0%），柚皮苷對照品（批號為110722-201613，純度為94.3%），淫羊藿苷對照品（批號為110737-201516，純度為94.2%），五味子醇甲對照品（批號為110857-201714，純度為99.9%），均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純，德國Merck公司）；水為屈臣氏桶裝水，其他試劑均為化學純。

2 方法與結果

2.1 TLC鑒別

當歸：取樣品（批號為20180522）粉末10 g，加乙醇10 mL，回流10 min，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取當歸對照藥材1 g，同法制備對照藥材溶液。按處方和工藝制備缺當歸的陰性樣品，同法制備陰性對照品溶液。取上述對照藥材溶液5μL、供試品溶液和陰性對照品溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（9∶1，V/V）為展開劑，展開，在紫外光（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 A。

圖1 薄層色譜圖Fig.1 TLC chromatograms

熟地黃：取樣品（批號為20180522）粉末15 g，加乙酸乙酯30 mL，振搖提取2次，合并提取液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取熟地黃對照藥材4 g，同法制備對照藥材溶液。按處方和工藝制備缺熟地黃的陰性樣品，同法制備陰性對照品溶液。取上述對照藥材溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液各3μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯（1∶1，V/V）為展開劑，展開，噴以2，4-二硝基苯肼乙醇試液顯色，在日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的主斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 B。

川續斷：取樣品（批號為20180522）粉末20 g，加甲醇80 mL，超聲處理30 min，濾液蒸干，殘渣加水20 mL使溶解；水溶液加石油醚（30～60℃）40 mL，振搖提取，棄去石油醚液，水層加水飽和的正丁醇30 mL，振搖提取3次，合并提取液，蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。用甲醇制備每1 mL含5 mg的川續斷皂苷Ⅵ對照品溶液。按處方和工藝制備缺續斷的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。取上述對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液各3μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2，V/V/V）10℃以下放置的下層溶液為展開劑展開，噴以5%磷鉬酸乙醇試液顯色，在日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 C。

甘草：取川續斷鑒定項下的供試品溶液適量；取甘草對照藥材1 g，加甲醇20 mL，超聲30 min，濾液濃縮至2 mL，作為對照藥材溶液；按處方和工藝制備缺甘草的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。取上述對照藥材溶液、樣品溶液和陰性對照品溶液各3μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（6∶1∶2，V/V/V）為展開劑，展開，在紫外光燈（254 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的主斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 D。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Waters Symmetry C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇（A）-0.4%磷酸水溶液（B），梯度洗脫程序見表1；流速：1.0 mL/min；柱溫：35℃；檢測波長：260 nm（原兒茶酸），320 nm（阿魏酸），283 nm（柚皮苷），270 nm（淫羊藿苷），250 nm（五味子醇甲）；進樣量：10μL。分別吸取混合對照品溶液、供試品溶液和空白輔料溶液各適量，按擬訂色譜條件進樣測定，結果5個目標峰與相鄰峰的分離度均大于1.5，且理論板數均大于5 000。色譜圖見圖2。

圖2 系統適用性試驗高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of the system suitability test

表1 流動相梯度洗脫程序（%）Tab.1 Gradient elution program of mobile phase（%）

2.2.2 溶液制備

取對照品原兒茶酸11.13 mg、阿魏酸9.77 mg、柚皮苷10.50 mg、淫羊藿苷10.81 mg、五味子醇甲10.05 mg，精密稱定，分別置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，制成對照品貯備液。分別精密量取原兒茶酸、阿魏酸及五味子醇甲對照品貯備液各1 mL，柚皮苷對照品貯備液0.15 mL，淫羊藿苷對照品貯備液3 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，即得混合對照品溶液。取樣品5 g，精密稱定，置錐形瓶中，稱定質量，精密加入甲醇25 mL，加熱回流60 min，冷卻至室溫，用甲醇補足減失的質量，濾過，即得供試品溶液。按處方比例稱取空白輔料適量，按供試品溶液制備方法制備空白輔料溶液。

2.2.3 方法學考察

線性關系考察、定量限和檢測限確定：分別精密量取2.2.2項下混合對照品溶液0.1，0.2，0.5，1.0，5.0 mL，分別置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋并測定，以峰面積（Y）為縱坐標、對照品溶液質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標進行線性回歸，回歸方程見表2。分別以信噪比（S/N）為10∶1和3∶1時的質量濃度為定量限和檢測限。結果見表2。

表2 線性關系考察、定量限和檢測限確定結果Tab.2 Results of linear relation test，LOD and LOQ

精密度試驗：取2.2.2項下混合對照品溶液500μL，連續進樣測定6次，計算峰面積。結果原兒茶酸、綠原酸、柚皮苷、淫羊藿苷和五味子醇甲峰面積的RSD分別為0.23%，0.11%，0.86%，1.54%，0.62%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取樣品（批號為20180522）適量，依法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，24 h時進樣測定，計算峰面積。結果原兒茶酸、綠原酸、柚皮苷、淫羊藿苷和五味子醇甲峰面積的RSD分別為1.01%，0.96%，1.15%，0.61%，1.52%（n=6），表明供試品溶液于室溫放置24 h內穩定性良好。

重復性試驗：取樣品（批號為20180522）適量，依法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定6次，計算含量。結果原兒茶酸、阿魏酸、柚皮苷、淫羊藿苷和五味子醇甲的平均含量分別為41.74，16.04，3.68，80.06，33.05μg/g，RSD分別為1.56%，1.67%，1.02%，1.32%，1.99%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：分別精密量取2.2.2項下原兒茶酸、阿魏酸、柚皮苷、淫羊藿苷和五味子醇甲對照品貯備液1 000，400，100，2 000，800μL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，備用。取已知含量的樣品（批號為20180522，規格為每袋15 g）2.5 g，研細，精密稱定，依法制備供試品溶液，加入2.2.2項下混合對照品溶液1 mL，進樣測定，并計算回收率。結果見表3。

表3 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.3 Results of the recovery test（n=6）

2.2.4 樣品含量測定

取3批樣品，依法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，用外標法分別計算原兒茶酸、阿魏酸、柚皮苷、淫羊藿苷和五味子醇甲的含量。結果見表4。

表4 樣品含量測定結果（μg/g，n=3）Tab.4 Results of content determination of five components in the samples（μg/g，n=3）

3 討論

3.1 提取方法選擇

曾采用乙醇加熱回流代替乙醚超聲提取當歸。石油醚代替乙醚提取川續斷皂苷Ⅵ，避免了易制毒化學試劑的使用。曾分別以甲醇、30%甲醇水溶液、50%甲醇水溶液、70%甲醇水溶液和80%甲醇水溶液考察提取溶劑，且考察了不同超聲時間（20，30，45，60 min）對目標化合物提取的影響。結果以甲醇為提取溶劑進行加熱回流時目標化合物響應較好，提取效率較高。

3.2 檢測波長選擇

曾采用二極管陣列檢測器進行全波長掃描稀釋劑超聲溶解的對照品，結果原兒茶酸、阿魏酸、柚皮苷、淫羊藿苷及五味子醇甲分別于260，316，280，270，250 nm波長處有最大吸收。

3.3 流動相選擇

曾采用乙腈-水溶液［3］、甲醇-水溶液［4］、0.01 mol/L己烷磺酸鈉-乙腈-甲醇-冰醋酸溶液（用三乙胺調節pH至3.0）［8］、0.2%己烷磺酸鈉（用冰醋酸調節pH至3.5）-甲醇-乙腈溶液［9］、緩沖液（0.11%己烷磺酸鈉、0.02%庚烷磺酸鈉混合溶液，每1 000 mL加0.2 mL三乙胺，用5%磷酸溶液調節pH至3.5）-乙腈-甲醇溶液（70∶10∶20，V/V/V）［10］、0.01mol/L庚烷磺酸鈉-乙腈-三乙胺溶液［11］、甲醇-0.1%磷酸水溶液等作為流動相對多組分進行洗脫，結果峰寬過大、前延拖尾、分叉峰及分離度過小，干擾目標峰檢測。最終選擇以甲醇-0.4%磷酸水溶液作為流動相進行梯度洗脫，處方中其他物質對5種待測組分無干擾，均能檢出，相較參考文獻中其他方法的色譜峰峰形良好，分離良好，操作簡便。

3.4 方法評價

本方法操作簡單，結果準確可靠，重復性和穩定性均較好，可用于回春育子顆粒的質量控制。