重慶市地產(chǎn)藥材蓼子草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

陳 健，李洪剛

（重慶市涪陵食品藥品檢驗(yàn)所，重慶 408000）

蓼子草常用于治療痢疾、腸炎、食滯，滅蛆，外用治療皮膚瘙癢，為川渝地區(qū)常用中藥材。蓼子草為蓼科蓼屬植物水辣蓼Polygonum hydropiperL.或旱辣蓼Polygonum flaccidumMeisn.的新鮮或干燥全草，夏、秋二季花開時(shí)采挖，除去雜質(zhì)，鮮用或曬干。水辣蓼分布于東北、華北、河南、陜西、甘肅及長(zhǎng)江以南的各省區(qū)，旱辣蓼分布于東北、江西、福建、廣東等地，四川省及重慶市各地均產(chǎn)［1-2］。為了有效控制蓼子草藥材的質(zhì)量，參考文獻(xiàn)［3-16］，本研究中采用顯微鑒別法和薄層色譜（TLC）法定性鑒別其成分金絲桃苷，以及采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定其槲皮素的含量。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

安捷倫1260型高效液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)安捷倫科技有限公司），配有二極管陣列檢測(cè)器（DAD）；XPE205型分析天平（美國(guó)Mettler公司，精度為十萬(wàn)分之一）；DP73型電子顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；HH-6D型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州市金壇友聯(lián)儀器研究所）；薄層層析硅膠G板（青島海洋生物制品廠）。

1.2 試藥

蓼子草（自采，分別自擬批號(hào)為2019-L-01，2019-L-02，2019-L-03，2019-L-04，2019-L-05，2019-L-06，2019-L-07），經(jīng)重慶市涪陵食品藥品檢驗(yàn)所陳健副主任中藥師鑒定為正品；槲皮素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為100081-201610，純度≥99.8%）；鹽酸（分析純，成都科龍化工試劑廠，批號(hào)為190401）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別

取樣品粉末，置顯微鏡下觀察。粉末呈灰綠色至黃綠色；葉表皮細(xì)胞類多角形或垂周壁微波狀彎曲；氣孔多平軸式，少有不定式；副衛(wèi)細(xì)胞2～4個(gè)；非腺毛黃綠色，壁木化增厚，常多根重疊；草酸鈣簇晶體散在，多見(jiàn)，直徑30～90μm；花粉粒圓球形，表面有網(wǎng)狀雕紋，外壁齒狀突出，直徑約40μm；纖維成束，壁增厚。詳見(jiàn)圖1。

圖1 蓼子草顯微特征圖Fig.1 Microscopic characteristics of Polygonum criopolitanum

2.2 TLC鑒別

取樣品粉末1 g，精密稱定，加稀乙醇30 mL，水浴回流1 h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，加入乙酸乙酯20 mL振搖提取，分取乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取金絲桃苷對(duì)照品，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的對(duì)照品溶液。照2020年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502 TLC法，吸取上述2種溶液各2μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G板上，以二氯甲烷-甲醇-甲酸（80∶20∶3，V/V/V）的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，晾干，105℃加熱5 min，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜圖中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。詳見(jiàn)圖2。

圖2 金絲桃苷薄層色譜圖（365 nm）Fig.2 TLC chromatogram of hyperoside（365 nm）

2.3 含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4.6mm，5μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；流動(dòng)相：甲醇-0.4%磷酸水溶液（55∶45，V/V），使用前經(jīng)0.45μm有機(jī)濾膜抽濾并脫氣；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。在此色譜條件下，供試品溶液色譜圖中，在與對(duì)照品溶液色譜相同保留時(shí)間處有色譜峰出現(xiàn)。詳見(jiàn)圖3。通過(guò)樣品光譜掃描，發(fā)現(xiàn)純度大于98%，表明分離效果良好。

圖3 高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms

2.3.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：取槲皮素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含30μg的溶液，即得。

供試品溶液：將樣品粉末過(guò)3號(hào)篩，取2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇-25%鹽酸溶液（4∶1，V/V）100 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇-25%鹽酸溶液（4∶1，V/V）補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別精密量取對(duì)照品溶液各1，5，10，25，50 mL，加甲醇分別定容于100 mL容量瓶中，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=15.148X+7.3025（r=0.9999，n=5）。結(jié)果表明，槲皮素的質(zhì)量濃度在1.42～71.20μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取同一質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果槲皮素峰面積的RSD為0.42%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為2019-L-01）樣品2g，精密稱定，共6份，按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算含量。結(jié)果槲皮素含量的RSD為1.68%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，室溫放置，分別于配制后0，2，4，8，12，24 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果槲皮素峰面積的RSD為1.06%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為2019-L-01）已知含量的樣品適量，共6份，精密稱定，精密加入槲皮素對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為0.500 2 mg/mL）適量，依法制備供試品溶液，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 槲皮素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.3.4 樣品含量測(cè)定

取7批（批號(hào)分別為2019-L-01，2019-L-02，2019-L-03，2019-L-04，2019-L-05，2019-L-06，2019-L-07）樣品各適量，依法制備供試品溶液，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果樣品中槲皮素的含量分別為0.07%，0.10%，0.08%，0.09%，0.08%，0.08%，0.09%，平均含量為0.08%。

3 討論

關(guān)于品種的來(lái)源，沿用《四川省中藥材標(biāo)準(zhǔn)（1987年版增補(bǔ)本）》中記載蓼科多種植物作辣蓼藥用，強(qiáng)調(diào)“味不辣不用，有辣味者可用”［1］，市售品主要為水辣蓼和旱辣蓼的新鮮或干燥全草，故收入標(biāo)準(zhǔn)。

關(guān)于顯微特征的確定，課題組通過(guò)大量試驗(yàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，2種來(lái)源的蓼子草粉末顯微特征無(wú)明顯差異，故合并描述。

進(jìn)行TLC鑒別時(shí)發(fā)現(xiàn)，中國(guó)食品藥品檢定研究院未供應(yīng)蓼子草對(duì)照藥材，自行制備又不具備條件，故選用金絲桃苷為陽(yáng)性對(duì)照，考察了多種展開系統(tǒng)，最后確定以二氯甲烷-甲醇-甲酸（80∶20∶3，V/V/V）的下層溶液為展開劑。結(jié)果供試品溶液色譜圖中斑點(diǎn)顯色清晰，分離效果好，專屬性強(qiáng)，故選定此流動(dòng)相為展開劑。

含量測(cè)定時(shí)，考察指標(biāo)性成分時(shí)發(fā)現(xiàn)金絲桃苷易水解，不穩(wěn)定，故選取其苷元槲皮素作為指標(biāo)性成分。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，蓼子草中槲皮素的含量較高，HPLC法測(cè)定含量技術(shù)較成熟。綜合考慮，參考《中國(guó)藥典》銀杏葉（總黃酮醇苷）含量測(cè)定方法［9］，采用HPLC法測(cè)定蓼子草中槲皮素的含量。經(jīng)研究選用甲醇-25%鹽酸溶液（4∶1，V/V）加熱回流1 h制備供試品溶液。考察了樣品的回流提取時(shí)間，分別測(cè)定回流提取0.5，1.0，2.0，4.0 h時(shí)樣品的含量，結(jié)果回流提取1.0 h的含量基本達(dá)到最高，故被選定。

綜上所述，本研究中建立的方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，專屬性強(qiáng)，穩(wěn)定性和重復(fù)性均較好，可用于蓼子草的質(zhì)量控制。