高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定海珠喘息定片中槲皮素和山柰酚含量*

周 峰，江 勛，彭婷婷

（湖南省衡陽市市場(chǎng)監(jiān)督檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖南 衡陽 421001）

海珠喘息定片由珍珠層粉、胡頹子葉、天花粉、蟬蛻、防風(fēng)、冰片、甘草、鹽酸氯丙那林、鹽酸去氯羥嗪制成，具有平喘、祛痰、鎮(zhèn)靜、止咳功效，也用于治療支氣管哮喘、慢性氣管炎［1］，可改善慢性喘息性支氣管炎平穩(wěn)期的咳喘癥狀［2-3］。現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)收載于1994年版《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑（第九冊(cè)）》，另有國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)YBZ02382007，二者內(nèi)容一致，但均無定量測(cè)定方法，文獻(xiàn)［4-6］僅涉及方中冰片、鹽酸氯丙那林、鹽酸去氯羥嗪等成分的定量分析。胡頹子葉為海珠喘息定片方中的主藥，是胡頹子科植物胡頹子Elaeagnus pungensThunb.的干燥葉，主治肺虛咳嗽、氣喘、咳血、吐血、癰疽、痔瘡、腫痛等癥，其提取物具有止咳、祛痰、平喘、廣譜抗菌等作用［7-11］。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于1977年版《中國(guó)藥典（一部）》含量控制項(xiàng)。參考文獻(xiàn)［12-17］和前期樣品分析結(jié)果，本研究中建立了測(cè)定海珠喘息定片中主藥胡頹子葉的指標(biāo)性成分槲皮素和山柰酚含量的高效液相色譜法，為提升該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

SHIMADZU LC-20AT型液相色譜儀（日本島津公司），配有SPD-M20A型檢測(cè)器；AE240S型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)公司，精度為十萬分之一）；XMTD-4000型八孔電熱恒溫水浴鍋（北京永光明醫(yī)療器械廠）。

1.2 試藥

槲皮素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為100081-201610，純度為99.1%）；山柰酚對(duì)照品（樂美天醫(yī)藥德斯特生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為DST200829-056，純度為98%）；乙腈（批號(hào)為N9CA1H）、甲醇（批號(hào)為T3AG1H）均為色譜純，購(gòu)自美國(guó)Honey Well公司；實(shí)驗(yàn)用水為屈臣氏蒸餾水（批號(hào)為20190910C），其他試劑均為分析純；海珠喘息定片（沈陽紅藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)分別為190201，190501，180701；洛陽天生藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)分別為190402，190102；江西南昌桑海制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)為190359；廈門中藥廠有限公司，批號(hào)分別為191017，181226，191106，190601，181207，181208）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Shimadzu Shim-pack GIST-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.4%磷酸水溶液（50∶50，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；進(jìn)樣量：20μL。

2.2 溶液制備

分別取槲皮素、山柰酚對(duì)照品各適量，精密稱定，分別加甲醇制成每1 mL含429.4μg槲皮素和295.7μg山柰酚的對(duì)照品貯備液；分別精密量取對(duì)照品貯備液各適量，置同一50 mL容量瓶中，加甲醇制成每1 mL含槲皮素、山柰酚分別為8.588 0，5.913 3μg的混合對(duì)照品溶液。

取樣品10片，研細(xì)，取粉末1.5 g，精密稱定，至帶塞錐形瓶中，加甲醇-25%鹽酸溶液（4∶1，V/V）的混合溶液50 mL，加熱回流30 min，放冷，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，并加甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

按海珠喘息定片處方工藝制備缺胡頹子葉的陰性對(duì)照樣品，并依法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下3種溶液各適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖見圖1。結(jié)果顯示，陰性對(duì)照品溶液在對(duì)照品溶液色譜峰相應(yīng)位置上無吸收峰，表明樣品中其他物質(zhì)不影響樣品的測(cè)定結(jié)果，方法專屬性強(qiáng)。在該色譜條件下，各成分可達(dá)到基線分離，分離度均大于1.5。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察、檢測(cè)限和定量限確定：取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶0.50，1.25，2.50，3.50，5.00，6.00，7.50，9.00，10.00 mL，分別置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。以信噪比（S/N）為3∶1時(shí)的含量為檢測(cè)限，以信噪比為10∶1時(shí)的含量為定量限。結(jié)果見表1。

表1 槲皮素和山柰酚線性關(guān)系考察結(jié)果及檢測(cè)限和定量限Tab.1 Results of linear relation test，LOD and LOQ

精密度試驗(yàn)：精密吸取混合對(duì)照品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定5次，記錄色譜圖。結(jié)果槲皮素和山柰酚峰面積的RSD分別為0.64%和1.01%（n=5），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為190359）樣品，研細(xì)，平行6份，并按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果樣品中槲皮素和山柰酚的含量分別為0.225 2 mg/g和0.154 5 mg/g，RSD分別為1.11%和1.96%（n=6）。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下制備的供試品溶液適量，分別于0，3，8，12，18，24 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果槲皮素和山柰酚含量的RSD分別為1.41%和1.28%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為190359）1.5 g，精密稱定，共9份，置帶塞錐形瓶中，分別精密加入槲皮素和山柰酚對(duì)照品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

表2 樣品中槲皮素和山柰酚加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test of quercetin and kaempferol in the samples（n=9）

耐用性試驗(yàn)：選取不同廠家的色譜柱（Shimadzu Shim-pack GIST-C18柱、Phenomenex Kinetex C18柱、Agela Venusi MPC18柱）及不同廠家和型號(hào)的高效液相色譜儀（Shimadzu LC-20AT型、Waters 2695型）測(cè)定供試品溶液，結(jié)果不同廠家色譜柱和不同型號(hào)儀器均能較好地分離樣品，耐用性良好。

2.4 樣品含量測(cè)定

取樣品1.5 g，精密稱定，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別平行測(cè)定2次，并計(jì)算槲皮素和山柰酚的含量。結(jié)果見表3。

表3 樣品中槲皮素和山柰酚含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n=2）Tab.3 Results of content determination of quercetin and kaempferol in the samples（mg/g，n=2）

3 討論

3.1 指標(biāo)性成分選擇

目前，從胡頹子葉中分離出的化學(xué)成分包括黃酮類、生物堿類、揮發(fā)油類、三萜類等，其中黃酮類化合物最多。胡頹子葉中總黃酮可舒張小鼠氣管平滑肌，其舒張作用機(jī)制與阻斷L型鈣通道電流有關(guān)［11］。因此，可以推斷海珠喘息定片中黃酮類化合物為其功效成分。但難以直接測(cè)定胡頹子葉中各種黃酮苷的含量，黃酮苷經(jīng)水解發(fā)現(xiàn)，其苷元主要為山柰酚、槲皮素和異鼠李素［9，18］，故選擇測(cè)定水解后產(chǎn)生的槲皮素與山柰酚代表成分的含量。

3.2 提取溶液體積選擇

考察了甲醇-25%鹽酸溶液（4∶1，V/V）混合溶液不同體積（30，40，50，60，70 mL），加入提取溶劑50 mL后，再增加體積，樣品溶液中提取的槲皮素和山柰酚的量無顯著差異，故選擇50 mL甲醇-25%鹽酸溶液（4∶1，V/V）作為提取溶液。

3.3 色譜條件選擇

比較了不同系統(tǒng)和比例的流動(dòng)相，如乙腈-0.1%磷酸水溶液梯度洗脫、甲醇-0.1%磷酸水溶液梯度洗脫、甲醇-0.4%磷酸水溶液（52∶48，V/V）等度洗脫等［13，15，19］，考慮到梯度洗脫較復(fù)雜，且分析時(shí)間過長(zhǎng)，選擇甲醇-0.4%磷酸水溶液（52∶48，V/V）等度洗脫為初始色譜條件，但試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)山柰酚與后面的峰分離效果不佳，經(jīng)反復(fù)摸索，調(diào)整為甲醇-0.4%磷酸水溶液（50∶50，V/V）。結(jié)果槲皮素、山柰酚與相鄰峰分離度均良好，且供試品溶液的分析時(shí)間控制也較合理。

3.4 樣品含量測(cè)定結(jié)果分析

由表3可知，不同生產(chǎn)廠家樣品間槲皮素和山柰酚的含量差異較大，同一生產(chǎn)廠家、不同批號(hào)間的差異較小，可能與不同生產(chǎn)廠家間胡頹子葉藥材的質(zhì)量差異及生產(chǎn)工藝有關(guān)。現(xiàn)有研究表明，不同產(chǎn)地胡頹子葉中槲皮素和山柰酚的含量存在差異［16］。

3.5 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立的高效液相色譜法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，專屬性強(qiáng)，重復(fù)性和穩(wěn)定性均良好，可用于海珠喘息定片的質(zhì)量控制。