全反式維甲酸對M1型巨噬細胞極化的影響

薛高峰，王琳源，關寧，高秀秋

（錦州醫科大學 1.附屬第二醫院牙周黏膜科；2.附屬第一醫院腦與脊髓損傷重點實驗室，遼寧 錦州 121000）

巨噬細胞是免疫系統的重要成員之一，在組織修復和抑制炎癥方面發揮重要作用。根據巨噬細胞在不同細胞因子作用下的極化特點，可分化為Ml（經典活化）型和M2（替代活化）型。巨噬細胞在干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ），脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）的刺激下極化為Ml型巨噬細胞［1-3］，可分泌腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6），白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β），白細胞介素-23（interleukin-23，IL-23），白細胞介素-12（interleukin-12，IL-12）和誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）等炎性細胞因子［4-5］，參與慢性根尖周炎、慢性牙周炎、炎癥性腸病等炎性疾病的發病過程［6-8］。抑制M1型巨噬細胞的極化可減輕組織炎癥程度，促進炎癥轉歸，維持組織穩態。

全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）又稱視黃酸、維甲酸等，是維生素A類衍生物，具有廣泛的免疫調節作用，在免疫細胞分化、活化和維持免疫系統的穩定過程中發揮多種功能，用于治療系統性紅斑狼瘡、炎癥性腸病、類風濕性關節炎等多種免疫性疾病［9-12］。然而，目前國內外關于ATRA對M1型巨噬細胞極化的調控作用研究較少。本研究通過體外建立M1型巨噬細胞極化模型，探討ATRA對M1型巨噬細胞極化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗采用8周齡、質量約20 g的SPF級 C57BL/6雌性小鼠，購自遼寧長生生物技術有限公司。本研究通過錦州醫科大學動物倫理委員會審核批準。

1.2 實驗材料

流式細胞儀（美國BD公司），實體顯微鏡（日本Olympus公司），RT-PCR儀和高速低溫離心機（美國Thermo公司），渦旋混合儀（中國其林貝爾儀器制造廠），電子天平（中國賽多利斯天平有限公司），迷你離心機（中國昊諾斯生物公司），微量加樣器（法國吉爾森公司），ATRA（中國Target MOL公司），RPMI1640培養基、胎牛血清（美國Invitrogen公司），F4/80抗體、iNOS抗體（美國Cell Signaling公司），Annexin V-PE/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒及反轉錄試劑盒（中國Vazyme公司），TRIzol（中國Ambion公司），iNOS、β-actin、TNF-α、IL-1β引物合成（中國鼎昌國盛有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 腹腔巨噬細胞的收集純化：取8周齡的C57BL/6小鼠頸部斷髓致死，無菌條件下用2%FBSPBS灌洗腹腔，收集腹腔液，離心并重懸細胞，臺盼藍拒染法計數活細胞＞95%，用RPMI1640完全培養基調整細胞密度，以一定細胞數接種于96孔培養板中，孵箱培養2 h后，吸上清液，去除未貼壁的細胞從而得到純化后的巨噬細胞。

1.3.2 實驗分組及條件：將細胞分為M組、M1組、DMSO組和ATRA組。見表1。IFN-γ（20 ng/mL）聯合LPS（100 ng/mL）誘導巨噬細胞向M1型極化后，加入ATRA（30 μg/mL）進行干預，孵箱孵育24 h。

表1 實驗分組及條件Tab.1 Experimental grouping and conditions

1.3.3 細胞形態學觀察：細胞培養24 h后，用倒置顯微鏡（×100）觀察各組細胞形態并進行拍照。

1.3.4 Annexin V-PE/7-AAD雙染法檢測細胞凋亡：依照試劑盒說明書將各組細胞樣本制成濃度為1×106/mL細胞懸液，吸取100 μL的重懸液到流式管中，加入5 μL Annexin V-PE和5 μL 7-AAD Staining Solution，混勻，避光室溫孵育10 min，加入400 μL 1×Binding Buffer，混勻，并用流式細胞儀進行檢測。實驗重復3次。

1.3.5 流式細胞術分析：將各組細胞懸液分別以細胞數1×106/管加入流式管并根據組別進行編號。用FITC標記的F4/80抗體以及相應的同型對照抗體進行胞外因子染色，用PE標記的iNOS抗體以及相應的同型對照抗體進行胞內因子染色，350 μL Staining Buffer洗滌重懸，流式細胞儀進行檢測。以前向散射角和側向散射角確定巨噬細胞群，應用FlowJo 7.6.1軟件分析F4/80+iNOS+M1型巨噬細胞。

1.3.6 實時PCR檢測：收集各組細胞后用TRIzol法提取細胞總RNA。通過紫外分光光度計測量RNA濃度及純度。操作完成后將提取的RNA反轉錄合成cDNA。按照反轉錄試劑盒說明進行操作，配置20 μL反應體系，每孔內依次加入2 μL cDNA，10 μL 2×mix，上、下游引物各0.4 μL，無菌水7.2 μL，進行擴增。引物設計：iNOS上游引物序列為5’-GGG TCACAACTTTACAGGGAGT-3’，下游引物序列為5’-G AGTGAACAAGACCCAAGCG-3’；TNF-α上游引物序列為5’-GATCGGTCCCCAAAGGGATG-3’，下游引物序列為 5’-TTGCTACGACGTGGGCTACA -3’；IL-1β上游引物序列為5’-TGCCACCTTTTGACAGTGATG-3’，下游引物序列為 5’-TGTGCTGCGAGATTTGA-3’；以β-actin為內參照物，β-actin上游引物序列為5’-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3’，下游引物序列為 5’-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3’。引物均由北京鼎國昌盛生物科技有限公司合成。反應條件：預變性95℃、30 s；循環反應95℃、5 s；60℃、30 s，共40個循環；溶解曲線 95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、15 s。每個樣本做3個復孔，實驗重復3次，取平均值。采用2-△△Ct法計算相對表達量。

1.4 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料以表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，2組間均數比較采用配對t檢驗，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞形態學觀察

倒置顯微鏡（×100）下觀察4組細胞在體外培養24 h后的細胞形態學表現。M組細胞主要呈圓形或橢圓形；M1組和DMSO組細胞主要表現為腎形，長梭形，細胞表面可見偽足；ATRA組與M1組相比，梭形細胞數量減少，圓形細胞數量增加且伸出偽足減少。見圖1。

圖1 各組細胞形態學觀察 ×100Fig.1 Cell morphology observation of each group ×100

2.2 各組細胞凋亡情況

Annexin V-PE/7-AAD雙染法檢測各組細胞凋亡情況，與M組相比較，M1組、DMSO組、ATRA組中細胞凋亡率無明顯差異（P＞ 0.05）；與M1組相比，ATRA組中細胞凋亡率無明顯改變，差異無統計學意義（P＞ 0.05）；M1組與DMSO組比較，差異也無統計學意義（P＞ 0.05）。見圖2。

圖2 巨噬細胞凋亡率的表達Fig.2 Expression of macrophage apoptosis rates

2.3 M1型巨噬細胞表達情況

LPS及IFN-γ共同處理后，與M組相比，M1組和DMSO組中F4/80+iNOS+M1型巨噬細胞表達增加，差異有統計學意義（P＜ 0.01）；與M1組比較，ATRA組中F4/80+iNOS+M1型巨噬細胞表達顯著下降，差異有統計學意義（P＜ 0.01）。DMSO組與M1組間差異無統計學意義（P＞ 0.05）。見圖3。

圖3 M1型巨噬細胞的表達Fig.3 Expression of M1 type macrophages

2.4 實時PCR檢測IL-1β、iNOS、TNF-α mRNA表達情況

通過實時PCR檢測各組細胞中M1型巨噬細胞相關因子IL-1β、iNOS、TNF-αmRNA表達情況：與M組相比，M1組和DMSO組細胞中IL-1β、iNOS、TNF-αmRNA表達顯著升高，差異有統計學意義（P＜ 0.01）；與M1組相比，ATRA組細胞中IL-1β、iNOS、TNF-αmRNA表達顯著下降，差異有統計學意義（P＜ 0.01）；DMSO組和M1組M1型巨噬細胞相關因子mRNA表達水平比較，差異無統計學意義（P＞ 0.05）。

3 討論

巨噬細胞是體內重要的吞噬和抗原提呈細胞，一方面通過非特異性識別抗原物質，對病原體進行吞噬，另一方面通過免疫應激，產生抗原提呈，啟動機體的免疫應答［13］。巨噬細胞具有高度異質性，經LPS刺激可誘導為M1型巨噬細胞，高表達ROS、iNOS、IL-6、1L-1β等，具有強大的抗微生物和抗腫瘤活性作用［14-15］。同時，iNOS和NO是NF-κB 信號轉導通路中重要的2種信號轉導分子，過量的致病性NO通過環氧合酶2可產生iNOS，介導組織損傷，引發炎癥反應發生，與過敏性哮喘、糖尿病、肥胖等多種疾病的發病機制相關。

圖4 M1型巨噬細胞相關因子IL-1β、iNOS、TNF-α mRNA的表達Fig.4 Expression of IL-1β，iNOS，and TNF-α mRNA in M1-type macrophages

ATRA是維生素A的重要活性代謝物，可調節腫瘤細胞的分化和凋亡，臨床中廣泛應用于血液系統腫瘤的治療［16-17］。近年來，有研究表明ATRA可通過調節巨噬細胞相關炎性細胞因子的產生，抑制炎癥反應發生。HUNG等［18］研究發現ATRA可通過抑制JNK-AP-1信號通路表達減少iNOS、NO和COX-2等巨噬細胞炎性細胞因子的產生，從而保護LPS所致的機體損傷，發揮其抗炎作用。ZHANG等［19］發現ATRA也可通過直接激活蛋白激酶抑制LPS刺激的巨噬細胞促炎因子IL-1β、TNF-α和iNOS等的生成。這些研究結果說明，ATRA可通過多條信號通路來發揮其對巨噬細胞的調控作用。但是，ATRA能否對M1型巨噬細胞的極化產生作用還不完全清楚，本研究發現，巨噬細胞經過ATRA（30 μg/mL）處理后，M1型巨噬細胞比例及相關細胞因子IL-1β、iNOS、TNF-αmRNA表達降低；并且通過細胞凋亡率檢測發現，ATRA在濃度為30 μg/mL時對巨噬細胞無細胞毒性作用，表明ATRA（30 μg/mL）可有效抑制巨噬細胞向M1型巨噬細胞極化。

ATRA可通過多種途徑調節巨噬細胞極化。LI等［20］發現巨噬細胞可通過Toll樣受體4（toll-like receptors 4，TLR4）激活IκB激酶（IκB kinase，IKK）復合物，從而調節巨噬細胞的M1型極化。而ATRA可通過抑制核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）激活，阻斷TLR4/NF-κβ信號通路的表達［21］；馬志新等［22］發現巨噬細胞通過CD14和CR3激活磷脂酶C，產生蛋白激酶C和磷脂酰肌醇3-激酶，從而活化PI3K/Akt通路，調節M1型巨噬細胞極化。而ATRA可通過抑制PI3K激活阻斷PI3K/Akt信號通路的表達［23］，從而影響M1型巨噬細胞極化。因此，推測ATRA可能通過阻斷多條信號通路的表達抑制M1型巨噬細胞的極化，這些機制可能是ATRA抑制M1型巨噬細胞極化的原因。

綜上所述，本研究發現ATRA（30 μg/mL）對巨噬細胞無細胞毒作用且在體外可抑制M1型巨噬細胞極化，提示ATRA有可能成為一種用于治療M1型巨噬細胞相關疾病的有效藥物。值得注意的是，ATRA作為體內維生素A的代謝中間產物，可能通過多種機制來影響M1型巨噬細胞極化，其有關機制還有待于進一步研究。