結直腸癌RNA結合蛋白相關長鏈非編碼RNA預后模型的構建與應用*

劉娟 彭洪 吳洪 柏丹 舒子龍 屈艷 敬劍英 楊淑娟

(1. 南充市中心醫院肛腸外科，四川 南充 637000；2.南充市中心醫院胃腸外科, 四川 南充 637000；3.川北醫學院附屬醫院腎內科, 四川 南充 6370004；4.南充市中心醫院產科，四川 南充 637000)

結直腸癌不僅是全球第三大最常見惡性腫瘤，也是全球第四大癌癥死亡原因，嚴重威脅著人類健康[1]。盡管結直腸癌的治療取得了很多新進展，但距患者期盼仍有很大差距，因此深入了解腫瘤發生的分子機制及尋找新的治療靶點已是目前臨床研究熱點。

RNA結合蛋白(RNA-binding proteins，RBP)是一類重要的細胞蛋白，其可通過識別特異性的RNA結合域與RNA相互作用，廣泛參與多種轉錄后調控，如RNA剪切、轉運、序列編輯、細胞內定位和翻譯控制等[2-3]。RBP與多種人類疾病相關，并參與惡性腫瘤的發生、發展[4-7]。長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，IncRNA)是一類長度大于200核苷酸的RNA分子，占人類基因組的70%[8]。過去IncRNA曾被認為是基因組RNA中的轉錄噪聲，但是越來越多研究表明IncRNA在表觀遺傳、轉錄或轉錄后水平對基因表達具有調控作用[9-12]，并且IncRNA在多種惡性腫瘤中表達異常，并參與腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲和轉移等多種生物學過程[13-15]。IncRNA的異常表達與腫瘤的進展，包括臨床病理特征和生存率之間存在顯著相關性，這表明IncRNA可作為各種惡性腫瘤的分子標志物[16]。

結直腸癌(Colorectal cancer，CRC)預后具有高度的異質性，而既往研究表明RBP和IncRNA均可作為CRC診斷和預后的分子標志物，因此可用于預測CRC患者的預后，并可以作為潛在的治療靶點。本研究擬構建結直腸癌RBP相關IncRNA預后模型，旨在為改善CRC患者的預后及臨床治療提供新方向。

1 資料與方法

1.1 資料 從TCGA數據庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)獲取398例結直腸癌組織標本與39例正常組織標本(結直腸癌旁正常組織)轉錄組數據與臨床數據。從(https://ebiac.uk/GOA/)獲取RBP相關基因。本研究的所有數據都在網上公開，并且本研究不需要在人類或動物身上進行實驗。

1.2 差異表達基因的數據處理 通過R軟件分析結直腸癌組和正常組樣本之間的RBP基因，篩選出腫瘤和正常樣本中差異表達的RBP基因。

1.3 差異表達基因的GO富集分析 GO(Gene ontology)分析是大規模基因功能富集分析的常用方法，基因功能分為生物過程(Biological processes，BP)、細胞成分(Cellular components，CC)和分子功能(Molecular functions，MF)。利用R 4.0.3 clusterProfiler程序包進行基因功能富集分析，并繪制條形圖和氣泡圖，P<0.05為結果有統計學意義。

1.4 RBP相關IncRNA的篩選 采用Pearson相關性分析篩選與RBP差異表達基因相關的IncRNA，滿足R2>0.4,P<0.001的IncRNA被認為是RBP相關IncRNA。

1.5 數據初篩 刪除在CRC患者中生存時間少于30 d以及臨床數據缺失的患者，最后進行生存分析的數據集包括355例CRC患者的RBP相關基因表達數據和臨床資料。再利用R軟件中caret程序包將用于預后分析的355例TCGA的HCC數據集樣本按50%與50%的比例分為訓練集(n=178)和內部驗證集(n=177)。

1.6 預后RBP相關IncRNA的鑒定 應用單因素回歸分析、Lasso分析和多元回歸分析等方法探討RBP相關IncRNA與患者OS的相關性。在單因素Cox回歸分析中，當P<0.05時該IncRNA被視為候選預后RBP相關IncRNA，接下來再進行Lasso分析和多元回歸分析以進一步篩選。

1.7 風險評分公式的建立 將篩選后的三個RBP相關lncRNA用于構建預后模型，使用風險評分公式計算風險評分，風險評分公式：Risk Score(patient) = Σi Coefficient(lncRNAi) ×Expression(lncRNAi)。coef值是通過多因素 Cox 回歸分析得到的回歸系數；患者RBP相關lncRNA表達量定義為expr lncRNA。

1.8 預后模型有效性驗證 根據三個RBP相關lncRNA表達水平分別計算訓練集和測試集中每個患者的風險得分，按照風險評分的中位值將患者分為低風險組和高風險組，同時進行ROC、Kaplan-Meier曲線和獨立預后分析，篩選獨立的預后因素，包括年齡、性別、分級、TNM分期和風險值高低。接下來納入所有的獨立預后因素，構建建諾模圖預測結直腸癌患者1、2、3年生存率并繪制標準曲線。

2 結果

2.1 差異表達的RBP基因的鑒定 從結直腸癌組和正常組樣本中共獲得493個差異表達的RBP基因，其中327個基因表達上調，166個基因表達下調，見圖1。

圖1 差異表達的RBP基因的熱圖和火山圖

2.2 RBP差異基因功能富集 GO富集分析的BP、CC和MF部分各選擇了前10個最相關的功能。對于上調表達的RBP差異基因，基因功能主要富集在lncRNA加工，核糖體合成，rRNA代謝過程，rRNA加工，核酸磷酸二酯鍵水解，RNA定位，前核糖體，細胞質核糖核蛋白顆粒，RNA生物催化活性，核酸酶活性等。下調表達的RBP差異基因主要在細胞酰胺代謝過程調控，翻譯調控，RNA剪接，mRNA代謝過程調控，RNA分解代謝過程，mRNA分解代謝過程，細胞質核糖核蛋白顆粒，核糖核蛋白顆粒，核斑點，RNA生物催化活性，mRNA 3,-UTR結合等功能方面富集，見圖2～3。

圖2 上調表達RBP差異基因GO富集分析

圖3 下調表達RBP差異基因GO富集分析

2.3 RBP相關基因-IncRNA共表達網絡的構建 差異表達的493個RBP相關基因與lncRNA進行相關性分析，相關系數大于0.4的lncRNA被認為是RBP相關lncRNA，共有994個lncRNA被鑒定為RBP相關lncRNA。

2.4 與預后相關的RBP相關lncRNA的確定 通過單因素回歸分析、Lasso回歸分析和多元回歸分析等方法對預后相關的RBP相關lncRNA進行鑒定，最終有3個RBP相關lncRNA用于構建預后模型，并構建RBP相關差異基因-lncRNA交互網絡，見圖4～5。

圖4 CRC中3個IncRNA與RBP差異表達基因共表達網絡圖

圖5 3個預后相關lncRNA的生存曲線圖

2.5 建立預后模型 使用多變量Cox風險回歸模型計算3個RBP相關lncRNA風險系數(表1)，用于計算風險得分的風險公式如下：風險分數=0.186822דNKILA”表達量+0.181553דLINC02474”表達量+0.660613דZEB1-AS1”表達量。

表1 3個RBP相關lncRNA多因素Cox回歸分析

2.6 預后模型分析 根據風險評分結果，3個RBP相關lncRNA在高分組和低分組的表達明顯不同，并且表達水平愈高風險得分愈高，致死率也愈高。KaplanMeier生存曲線顯示，高風險組的OS明顯差于低風險組。此外，ROC分析表明，該模型可以較為有效地預測患者1、2、3年的OS(1、2、3年AUC分別為0.730、0.712、0.772)，見圖6。

圖6 訓練集預后模型分析

2.7 預后模型與臨床特征的關系 使用單因素Cox回歸和多因素Cox回歸分析風險評分與臨床病理特征的關系。單因素Cox回歸分析表明腫瘤分級、TNM分期和風險評分與CRC患者OS顯著相關，多因素Cox回歸分析表明年齡、腫瘤大小和風險評分是獨立預后因子，見圖7。

圖7 預后模型與臨床特征的關系

2.8 諾模圖的構建 根據患者的臨床特征，將臨床性狀進行二分類(如年齡分為<65歲及≥65歲)構建諾模圖，并繪制諾模圖的標準曲線。結果表明諾模圖預測1年和2年生存率優于3年生存率，因為在1年和2年生存率預測中，實際和預測的生存率相差較小。根據標準曲線表明這個模型對結直腸癌患者預后的預測具有比較大的優勢，見圖8。

圖8 諾模圖可預測患者生存率

2.9 內部驗證 內部驗證集中的177例CRC患者按照風險評分的中位值將患者分為低分組和高分組，結果表明3個RBP相關lncRNA表達水平在高分組中明顯高于低分組，表達水平愈高風險得分愈高。KaplanMeier生存曲線顯示，高風險組CRC患者的OS明顯差于低風險組。ROC分析結果表明，1、2和3年AUC分別為0.735、0.769、0.777，說明該模型可以較為有效地預測患者1年、2年和3年的OS，同訓練集中的預測結果相似，見圖9。

圖9 驗證集預后模型分析

單因素Cox回歸分析表明腫瘤分級、腫瘤侵潤程度、淋巴結轉移和風險評分與CRC患者OS顯著相關，多因素Cox回歸分析表明風險評分是獨立預后因子，見圖10。

圖10 預后模型與臨床特征的關系

3 討論

基因組的大部分被轉錄成非(蛋白質)編碼的RNA片段，其中lncRNAs在細胞中占轉錄產物的絕大多數，它們控制著轉錄、剪接、RNA穩定性和翻譯等細胞進程[17]。RBP可動態協調各種RNA的成熟、運輸和穩定性[18]，如與68KDa有絲分裂相關的SRC(SAM68)是RNA結合蛋白STAR家族(Signal transduction and RNA metabolism activation)的一員，它參與mRNA代謝的幾個步驟如轉錄、選擇性剪接和核輸出。此外SAM68與細胞對刺激的反應、細胞周期轉換和病毒感染所需的信號轉導通路相關[19-20]。TARBP2在轉移性乳腺癌患者中過表達，其異常激活可通過影響靶mRNA的穩定性而促進乳腺癌的進展，還可以增強乳腺癌患者對三苯氧胺的耐藥性[21-22]。因此RBP表達水平或功能的改變可產生重要的影響。然而到目前為止只有少數與癌癥相關的lncRNAs可與RBP相互作用參與腫瘤進展。因此，本研究對RBP相關IncRNA與CRC預后的關系進行了深入分析。對CRC中表達的RBP基因進行綜合分析，共鑒定出503個差異表達的RBP基因，其中327個基因表達上調，166個基因表達下調。對于上調表達的RBP差異基因，基因功能主要富集在ncRNA加工，核糖體合成，rRNA代謝過程，下調表達的RBP差異基因主要在細胞酰胺代謝過程調控，翻譯調控，RNA剪接，mRNA代謝過程調控，RNA分解代謝過程等功能方面富集。進一步構建了RBP相關基因-IncRNA共表達網絡，發現994個lncRNA被鑒定為RBP相關lncRNA。通過單因素回歸分析、Lasso分析和多元回歸分析等方法最終選擇了LINC02474, NKILA,和ZEB1-AS1作為評估CRC預后的RBP相關lncRNA，并推算出風險公式(風險分數=0.186822דNKILA”表達量+0.181553דLINC02474”表達量+0.660613דZEB1-AS1”表達量)。對TCGA數據集進行篩選后根據數據集風險評分的中值將所有患者分為高風險組和低分險組，訓練集和驗證集中低分險組的OS均優于高風險組。ROC分析顯示本風險模型預測訓練集中CRC患者1、2、3年OS的AUC分別為0.730、0.712、0.772，驗證集則分別為0.735、0.769、0.777。并且單因素和多因素Cox回歸分析證實風險評分與CRC患者的OS顯著相關，表明風險評分是預測CRC患者預后的獨立指標。這些結果表明基于LINC02474, NKILA,和ZEB1-AS1的風險評分可以準確預測結直腸癌患者的預后。本研究中還建立了基于預后特征和臨床因素的諾模圖模型，結果表明諾模圖預測CRC患者1，2，3年生存率具有較好的性能，進一步證明了風險評分在預測CRC患者長期預后方面的可靠性。

本研究發現LINC02474, NKILA,和ZEB1-AS1這3個RBP相關IncRNA都與腫瘤有關， ZEB1-AS1在CRC組織中高表達，其表達水平與CRC患者OS和無復發生存率顯著相關。ZEB1-AS1可促進CRC細胞增殖并抑制細胞凋亡，其可能是通過抑制細胞周期抑制蛋白p15發揮作用[23]。并且ZEB1-AS1在肝癌組織和細胞中表達上調，其可通過靶向抑制miR-23c促進肝癌細胞的增殖和侵襲[24]。對于NKILA的研究表明NKILA可通過使T細胞對活化誘導的細胞死亡敏感來促進乳腺癌免疫逃逸，NKILA的過表達與細胞凋亡水平降低及患者生存期縮短相關，提示NKILA可作為抗腫瘤免疫治療的作用靶點[25]。但是LINC02474在腫瘤方面的研究還不夠深入，只有Wang等[26]的研究報道LINC02474是CRC患者預后相關的lncRNA，但其具體作用機制尚需進一步研究。

4 結論

本研究成功構建了結直腸癌RBP相關IncRNA預后模型，發現3個RBP相關IncRNA(LINC02474,NKILA,ZEB1-AS1) 可能是CRC的預測因子，并與CRC的發生、發展相關，為CRC的治療開辟了新的視角。LINC02474,NKILA,ZEB1-AS1等基因已被證實能影響腫瘤的進展，并有可能用于靶向治療。但是LINC02474,NKILA和ZEB1-AS1在結直腸癌細胞和動物中的研究較少，其具體作用機制也不明確，因此還需要更多的臨床數據及更深入的機制研究支持本研究的結論。